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      作者：張毅

      褪黑素是一種生物調(diào)制激素，對(duì)睡眠、促進(jìn)性腺發(fā)育和生理節(jié)奏具有重要作用。低水平的褪黑素已被證明在帕金森病( PD)，失眠、癲癇、缺血性損傷和神經(jīng)障礙有治療作用，此外，角色為褪黑激素在白內(nèi)障的發(fā)展，衰老和視網(wǎng)膜炎也被報(bào)道。除動(dòng)物來(lái)源外，從90年代開(kāi)始，人們陸續(xù)在許多高等植物中也發(fā)現(xiàn)了褪黑素的存在，包括大多數(shù)食用植物、部分菊科植物、藥用植物以及一些植物種子中也發(fā)現(xiàn)了褪黑素的存在，其中藥用植物中褪黑素的含量較高。

    研究褪黑素的檢測(cè)方法，可以鑒定相關(guān)天然食品褪黑素的含量，評(píng)估相關(guān)食品的合理飲食量，同時(shí)也可以檢測(cè)在中草藥中也有非法添加的褪黑素。目前非法添加化學(xué)物質(zhì)已成為中藥制劑造假的主要方式，例如在鎮(zhèn)靜安眠類(lèi)中添加地西泮、艾司唑侖、氯硝西泮、褪黑素等，這屬于藥品監(jiān)管部門(mén)嚴(yán)厲打擊的對(duì)象。

    目前，測(cè)定褪黑素的方法很多，如高效液相色譜-質(zhì)譜法( HPLC-MC)、毛細(xì)管電泳法(CE)、

氣相色譜-質(zhì)譜法( GC-MS)、熒光法、放射免疫分析法( RIA)、聯(lián)酶免疫分析法(ELISA)、光檢測(cè)

法、電泳法、以及電化學(xué)法等方法，試驗(yàn)主要對(duì)褪黑素的檢測(cè)方法進(jìn)行綜述。

1  褪黑素檢測(cè)方法

    進(jìn)行褪黑素的檢測(cè)，首先從樣品中提取褪黑素。從樣品中萃取或提取的褪黑素有多種方法，常用簡(jiǎn)單方法的萃取溶劑有乙醇、乙酸乙酯、甲醇、10%的Na2CO3磷酸鹽緩沖液。為了防止褪黑素在提取過(guò)程被氧化，也多采取在提取試劑中添加HC104、EDTA、和抗氧化劑的方法提取。在進(jìn)行色譜分析之前同樣也需要進(jìn)行前處理，以除去干擾物質(zhì)，常用液-液萃取( LLE)方法提取褪黑素或者分離雜質(zhì)，常用的萃取劑除雜，常用氯仿、甲醇等有機(jī)溶劑萃取并氮吹蒸干得到純度高物質(zhì)。從生物體內(nèi)或藥品中提取后的褪黑素經(jīng)過(guò)前處理可用于分析測(cè)定，表1列出幾種不同褪黑素的檢測(cè)方法。

2色譜法

    色譜法( Chromatography)是測(cè)定褪黑素的常用方法，檢測(cè)速度快、精度高，具有檢測(cè)可靠的特點(diǎn)，但成本高和工作大。常用HPLC-MS, HPLC-FD, HPLC-ECD, LC-MS, GC-MS。

    目前對(duì)于褪黑素的檢測(cè)應(yīng)用較廣為反相液相色譜。開(kāi)展出液相色譜一三重四極質(zhì)譜串  聯(lián)法( LC-MSIMS)檢測(cè)而啤酒，核桃，西紅柿和酸櫻桃樣品中的褪黑素及其同分異構(gòu)體，檢測(cè)下限為9.6～52.9 ng/g或ng/mL; LC-FD檢測(cè)一系列廣泛品種的西紅柿和草莓，檢測(cè)出褪黑素質(zhì)量濃度范圍為0.017～8.8 mg/L; Gonzalez-Gomezc以C18反相液相色譜柱檢測(cè)不同種類(lèi)的櫻桃褪黑素含量，檢測(cè)下限為4.3 ng/mL; 用C18反相色譜柱一大氣壓力化學(xué)電離質(zhì)譜串聯(lián)檢測(cè)葡萄皮、紅酒和植物中的褪黑素，最低LOD為0.12 pg; 開(kāi)展出快速液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法( LC-MSIMS)檢測(cè)海鰻中的褪黑素，檢測(cè)下限( LOD)分別為0.03 ng/mL。研究C18 BEH柱和通過(guò)在正離子模式下多反應(yīng)監(jiān)測(cè)電噴霧的質(zhì)譜裝置執(zhí)行的檢測(cè)意大利傳統(tǒng)芪葡萄產(chǎn)品中的褪 黑素及其同分異構(gòu)體。

  3光檢測(cè)法

    光檢測(cè)法包括熒光檢測(cè)法、紫外檢測(cè)法、發(fā)光檢測(cè)法等方法。常與高效液相色譜( HPLC)串聯(lián)使用。GB/T 5009.170-2003規(guī)定了褪黑素的檢測(cè)方法，包括熒光檢測(cè)法和紫外檢測(cè)法。其中紫外檢測(cè)法的檢出下限為0.5 ng，取樣量濃度為0.5 g時(shí)，檢出質(zhì)量濃度為0.07 mg/mL;熒光檢測(cè)法檢出下限為30 pg，其線性范圍為0.05 ng～0.50 ng。試驗(yàn)主要介紹熒光檢測(cè)法和紫外檢測(cè)法。

  3.1熒光測(cè)定法

    熒光測(cè)定法( Fluorescenee detection，F(xiàn)D)是利用熒光物質(zhì)吸收特征波長(zhǎng)的光后發(fā)射熒光，通過(guò)測(cè)定其熒光強(qiáng)弱來(lái)進(jìn)行定量分析。熒光測(cè)定法具有靈敏度高（靈敏度比分光光度法高1～3個(gè)數(shù)量級(jí)），選擇性高，線性范圍廣，以及測(cè)定結(jié)果與斑點(diǎn)形狀無(wú)關(guān)等優(yōu)點(diǎn)，常與HPLC或LC等串聯(lián)使用。Jose發(fā)展了雙氯仿萃取前處理HPLC-FD法檢測(cè)鱒魚(yú)的腸道中的褪黑素，以避免在檢測(cè)不同組織的提取物的干擾，檢測(cè)下限為8 pg/mL。HPLC-FD可用于檢測(cè)108種草藥中的褪黑素，其中檢測(cè)出64種中藥所含褪黑素超過(guò)10 ng/g（干重），其中有39褪黑激素水平超過(guò)100 ng/g（干重），10種已經(jīng)褪黑激素水平超過(guò)1 000 ng/g（干重）。Korkmaz探究了280 nm和350 nm的發(fā)射波長(zhǎng)的熒光檢測(cè)器檢測(cè)在不同的生長(zhǎng)階段分析在辣椒植物器官的褪黑激素的含量。

3.2紫外檢測(cè)法(UV)

    可見(jiàn)光、紫外線照射某些物質(zhì)，主要是由于物質(zhì)分子中價(jià)電子能級(jí)躍遷對(duì)輻射的吸收，而產(chǎn)生化合物的可見(jiàn)紫外吸收光譜。基于物質(zhì)對(duì)光的選擇性吸收的特性而建立分光光度法或稱吸收光譜法的分析方法。褪黑素屬于吲哚類(lèi)芳香化合物，具有苯環(huán)和含氮雜環(huán)，能夠吸收紫外光產(chǎn)生和躍遷。對(duì)于褪黑素進(jìn)行UV檢測(cè)的波長(zhǎng)范圍從200~223nm，對(duì)褪黑激素的檢測(cè)限從2 mg/L—0.2ug /L。urmeian采用稱為“零交叉”技術(shù)的二階或三階導(dǎo)數(shù)紫外光譜分析法檢測(cè)褪黑素，線性范圍是0.5～3.5ug/mL; Amnj等開(kāi)發(fā)出兩種簡(jiǎn)單、快速、靈敏和精 確的紫外檢測(cè)方法，用鄰二氮菲亞鐵離子或三價(jià)鐵離子與2，2-連吡啶分別于pH 4.6或pH 2.5的乙酸鈉緩沖液中70℃時(shí)對(duì)MT衍生化反應(yīng)10 min，然后分別在=510 nm或522 nm進(jìn)行UV吸收測(cè)定，線性范圍分別是0.4～6.4ug /mL和0.4~7.4 ug/mL。

  4電化學(xué)分析法

    電化學(xué)分析( Electrochemical Analysis)，是儀器分析的重要組成部分之一。它是根據(jù)溶液中物質(zhì)的電化學(xué)性質(zhì)及其變化規(guī)律，建立在以電位、電導(dǎo)、電流和電量等電學(xué)量與被測(cè)物質(zhì)某些量之間的計(jì)量關(guān)系的基礎(chǔ)之上，對(duì)組分進(jìn)行定性和定量的儀器分析方法。

4.1電泳法

    電泳分析( CE)具有高效率、樣品體積小、分析時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)，是一個(gè)非常重要的分離技術(shù)，特別是對(duì)于生物分子。它已經(jīng)被應(yīng)用于分離和測(cè)定的褪黑激素和相關(guān)的吲哚化合物。不同的CE檢測(cè)方法已經(jīng)用于測(cè)定的褪黑激素、其前體、以及代謝產(chǎn)物。由于這些化合物的電活性，陽(yáng)極電流檢測(cè)已成功在該范圍內(nèi)使用的以及獲得非常低的褪黑素檢測(cè)限( 0.3~27 mg/L)。在0.025 mol/L的磷酸鹽緩沖液(pH 8.3)12 min的條件中分離檢測(cè)褪黑素，所使用的工作電極是在一個(gè)壁射流配置操作的500-MUM直徑碳電極，檢出限為1.3×10-6 mol/L;  Ali通過(guò)使用熔融石英毛細(xì)電泳管( 60 cm×50 mm ID)、磷酸鹽緩沖液( 50 mmol/L，pH 3.0)作為背景電解質(zhì)(BGE)、20 kV的電壓施加、UV檢測(cè)波長(zhǎng)214 nm檢測(cè)褪黑素，其線性范圍是10～100ug /L。

4.2傳感器檢測(cè)法

    對(duì)于褪黑素的分析，傳感器分析具有速度極快、準(zhǔn)確度高、前處理要求低、檢出下限低等特點(diǎn)。其原理是利用對(duì)褪黑素敏感的原件作為檢測(cè)頭，將褪黑素的濃度轉(zhuǎn)換成電信號(hào)，從而進(jìn)行測(cè)定。

    利用摻硼金剛石電極，使用循環(huán)伏安法檢測(cè)褪黑素，在羅二氏緩沖劑、pH 3.0、正0.88 V（相對(duì)于Ag/AgCl電極）最佳條件下得到伏安響應(yīng)，檢出下限為0.025ug /mL; 利用由多個(gè)掃描循環(huán)伏安組成的錳六氰基鐵酸鹽( MnHCF)的混合價(jià)的聚（3，4-亞乙基）(PEDOT)的混合膜( MnHCF-PEDOT)玻碳電極檢測(cè)褪黑素，線性范圍較廣( 0.1～0.46 nmol/L)，檢測(cè)下限低(0.01 nmol/L)，響應(yīng)速度快(3 s)，具有易制備、特異性高、穩(wěn)定性好和重復(fù)性好的優(yōu)點(diǎn)；在弱酸條件下，以鄰苯二胺為功能單體，褪黑素為模板，以電化學(xué)聚合物法在鉑電極表面合成了性能穩(wěn)定的褪黑素分子印跡聚合物膜，采用循環(huán)伏安法( CV)和差分脈沖法( DPV)對(duì)分子印跡傳感器的識(shí)別性能進(jìn)行了研究，在1×10-8～1×10-10 mol/L的范圍內(nèi)，褪黑素的濃度與K3Fe(CN)6的相對(duì)峰電流變化呈良好的線性關(guān)系，檢出限( LOD)為1×10-11mol/L。

5免疫分析法

    免疫分析法是利用特定抗體對(duì)被檢測(cè)物質(zhì)特異性識(shí)別結(jié)合，通過(guò)直接或者間接檢測(cè)被檢物質(zhì)的方法，具有檢測(cè)速度快、靈敏度高、成本低等特點(diǎn)。免疫分析法主要有放射免疫測(cè)定法和聯(lián)酶免疫分析法。免疫分析法對(duì)于褪黑素的分析目前主要針對(duì)動(dòng)物體內(nèi)血液。

5.1放射免疫測(cè)定

    放射免疫測(cè)定( Radioimmunoassay，RIA)是利用放射性核素的測(cè)量方法與免疫反應(yīng)的基本原理相結(jié)合的一種放射性核素體外檢測(cè)法。該法有靈敏度高、特異性強(qiáng)、精確度佳及樣品用量少等優(yōu)點(diǎn)，因而發(fā)展迅速，但由于這種方法具有放射性元素，故在食品檢測(cè)領(lǐng)域中的應(yīng)用未見(jiàn)報(bào)道。

    通過(guò)用標(biāo)記褪黑素單克隆抗體進(jìn)行交叉反應(yīng)測(cè)試，除與N-乙酰血清素一個(gè)0.81%交叉反應(yīng)外，幾乎沒(méi)有與其他物質(zhì)進(jìn)行交叉反應(yīng)，線性檢測(cè)范圍是50 pg～100 ng; 褪黑素標(biāo)記物作為示蹤劑進(jìn)行抗血清的特異性分析，線性范圍是0.022~0.345pmol/藥瓶；褪黑素檢測(cè)昆蟲(chóng)血液中褪黑素的含量，檢測(cè)下限為40 pg/mL; 褪黑素和多克隆兔抗褪黑素血清結(jié)合的方法，測(cè)定雞血液和松果體中的褪黑素含量；褪黑素與高親和力特異性抗羊血清抗體結(jié)合，檢測(cè)各種動(dòng)物中松果體褪黑素含量，檢測(cè)下限為0.005 pmol/ mL，分別獲得大鼠、倉(cāng)鼠、綿羊和龜松果體勻漿平行抑制曲線。

5.2聯(lián)酶免疫分析法(ELISA)

    酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定( Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay，ELISA)指將可溶性的抗原或抗體結(jié)合到聚苯乙烯等固相載體上，利用抗原抗體結(jié)合專(zhuān)一性進(jìn)行免疫反應(yīng)的定性和定量檢測(cè)方法。ELISA包括競(jìng)爭(zhēng)法、雙抗體夾心法、抑制性測(cè)定法、間接性測(cè)定法等方法。

    設(shè)計(jì)用單克隆抗體ash-10對(duì)褪黑素進(jìn)行ELISA檢測(cè)，方法為高碘酸氧化法辣根過(guò)氧化物酶( HRP)標(biāo)記的直接競(jìng)爭(zhēng)的ELISA方法，為提高靈敏度，褪黑素與堿性磷酸酶共軛，檢測(cè)下限為100 ng/mL; 褪黑素與牛血清白蛋白( BSA)進(jìn)行偶合，注入Balb/c小鼠腹腔內(nèi)進(jìn)行免疫，其脾細(xì)胞產(chǎn)生抗體的高效價(jià)融合與SP2/0骨髓瘤起源細(xì)胞，制備兩種穩(wěn)定單克隆AS-H10和AS-D26，構(gòu)建出一個(gè)廣泛的線性檢測(cè)范圍(10 ng/mL～10 g/mL)；甲醛將褪黑素和牛血清蛋白進(jìn)行偶合，用多焦點(diǎn)真皮內(nèi)注射免疫Balb/c小鼠，通過(guò)PEG誘導(dǎo)的融合的免疫PLN和SP2/0細(xì)胞選擇了陽(yáng)性細(xì)胞株和所確定的單克隆抗體對(duì)MT的效價(jià)，獲得5株能分泌高特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞，用于ELISA檢測(cè)。

6結(jié)語(yǔ)與展望

    隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)發(fā)展和國(guó)民生活水平提高，群眾對(duì)健康生活和保健食品的需求也日益增加。自然界中許多動(dòng)植物都含有褪黑素，由于對(duì)于動(dòng)植物中的褪黑素含量了解甚少，因此不能評(píng)估合理有效的進(jìn)食量。同時(shí)，褪黑素類(lèi)產(chǎn)品已經(jīng)在國(guó)外廣泛應(yīng)用，幾年來(lái)我國(guó)也開(kāi)始大量開(kāi)發(fā)生產(chǎn)該類(lèi)產(chǎn)品。為達(dá)到保證褪黑素類(lèi)產(chǎn)品的質(zhì)量、保護(hù)消費(fèi)者身體健康的目的，必須發(fā)展褪黑素的檢測(cè)方法。

目前對(duì)于褪黑素檢測(cè)多數(shù)是采用儀器分析法，當(dāng)中高效液相色譜法( HPLC)最為普遍。儀器分析法具有靈敏度高，回收率高，線性范圍好，準(zhǔn)確度高的優(yōu)點(diǎn)。但由于儀器檢測(cè)前需要進(jìn)行復(fù)雜的前處理以及高成本等因素，一定程度上限制了褪黑素的檢測(cè)。對(duì)于ELISA和電化學(xué)傳感器這些快速檢測(cè)方法，優(yōu)點(diǎn)在于前處理要求相對(duì)較低，速度快，但多數(shù)是針對(duì)人體血液或其他動(dòng)物器官中的褪黑素檢測(cè)，專(zhuān)門(mén)針對(duì)食品基質(zhì)中褪黑素檢測(cè)的檢測(cè)方法較少。因此發(fā)展電化學(xué)傳感器、RIA、ELISA等快速檢測(cè)方法來(lái)進(jìn)行食品中褪黑素的檢測(cè)是未來(lái)對(duì)于褪黑素檢測(cè)發(fā)展的趨勢(shì)。

7摘要

褪黑素作為一種主要是由哺乳動(dòng)物和人類(lèi)的松果體產(chǎn)生的一種胺類(lèi)激素，具有安眠、抗衰老、抗腫瘤等作用，常作為輔助睡眠保健食品的功能因子之一，西紅柿、葡萄等食物中也含有褪黑素。研究褪黑素的檢測(cè)方法，可以鑒定相關(guān)天然食品褪黑素的含量，評(píng)估相關(guān)食品的合理飲食量，也可鑒定保健食品中褪黑素含量是否超標(biāo)或不達(dá)標(biāo)以及中草藥中非法的褪黑素。因此對(duì)褪黑素的檢測(cè)具有重要意義。對(duì)褪黑素的來(lái)源和功能做簡(jiǎn)單介紹，重點(diǎn)對(duì)褪黑素的檢測(cè)方法研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述。