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    作者：鄭曉敏

    大量研究表明，預(yù)處理所產(chǎn)生的抑制物質(zhì)會(huì)影響酵母的正常生長(zhǎng)和后續(xù)的發(fā)酵過(guò)程。因而，研究預(yù)處理后水解液中的抑制物組成成分，并尋找有效的脫毒方式，對(duì)于進(jìn)一步提升木質(zhì)纖維素降解率和生物乙醇產(chǎn)率具有重要意義。

    目前，人們對(duì)不同原料在各類(lèi)預(yù)處理方法與條件下所產(chǎn)生的抑制物已有廣泛研究，但主要集中在稀酸、蒸汽爆破、碳酸鈉一氧化水解等預(yù)處理手段。例如，Larsson等用稀硫酸在高溫蒸汽下水解云杉，發(fā)現(xiàn)主要水解液中的主要抑制物為乙酸、甲酸、乙酰丙酸、糠醛和羥甲基糠醛等；Martin等用蒸汽爆破一酶解法處理甘蔗渣，發(fā)現(xiàn)乙酸、甲酸、糠醛、羥甲基糠醛、酚類(lèi)化合物等為主要抑制物；Klinke等[8]用碳酸鈉一氧化水解法水解麥草，結(jié)果表明乙酸、甲酸、羥基乙酸、蘋(píng)果酸、酚類(lèi)化合物等為主要抑制物。然而，關(guān)于氫氧化鈉預(yù)處理對(duì)木質(zhì)纖維素水解液中抑制物組成成分的影響和水解液中主要抑制物的研究少有報(bào)道。

    本課題組前期研究結(jié)果表明，氫氧化鈉預(yù)處理是一種較為有效的稻草秸稈生產(chǎn)燃料乙醇過(guò)程中的預(yù)處理手段，其最優(yōu)預(yù)處理?xiàng)l件為：NaOH濃度為2%( w/w)，溫度為85℃時(shí)處理l h。文章采用萃取濃縮一氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(EE-GCfMS)，對(duì)經(jīng)最優(yōu)條件下堿預(yù)處理后和未經(jīng)堿預(yù)處理的稻草秸稈水解液中的抑制物組成成分進(jìn)行了初步研究，并分析了主要抑制物的抑制機(jī)理和抑制作用，可為針對(duì)性消除堿預(yù)處理時(shí)產(chǎn)生的有毒抑制物對(duì)后續(xù)酵母發(fā)酵產(chǎn)燃料乙醇的不良影響提供一定的科學(xué)依據(jù)。

  1實(shí)驗(yàn)部分

  1.1材料與方法

  1.1.1稻秸原料的采集

    稻草秸稈于2013年10月采自上海市閔行區(qū)吳涇鎮(zhèn)的農(nóng)田。帶回實(shí)驗(yàn)室用清水洗凈3遍，去除稈節(jié)，烘干后備用。

  1.1.2稻草秸稈水解液的制備

    用粉碎機(jī)將稻秸粉碎，并過(guò)40'目篩，取所得樣品10 g于具塞三角燒瓶中；添加100 mL 2%(w/w)氫氧化鈉溶液于該燒瓶中，85℃水浴加熱處理樣品th，室溫冷卻靜置20 min。添加等量純水的空白樣作為對(duì)照組。

  1.1.3稻草秸稈水解液的萃取濃縮

    取靜置后上層溶液40 mL，在Thermo冷凍離心機(jī)上在25℃（室溫）溫度條件下以4 500 r/min離心5mm;取離心后清液30 mL于分液漏斗中，在各分液漏斗中分別加1.5 mol/L的硫酸溶液將其pH調(diào)至2左右，以使酚鈉鹽成為酚類(lèi)物質(zhì)，再分別加入7.5 g硫酸銨（提高萃取率）、20 mL二氯甲烷，振蕩萃取10 min，靜置10 min;取下層萃取液15 mL于離心機(jī)上原速離心5 min;取10 mL離心后清液于試管中，加入等量的硫酸溶液進(jìn)行酸洗；取下層酸洗后的清液8 mL于40℃下蒸發(fā)濃縮30 min左右至0.5 mL，用于Agilent7890A氣質(zhì)聯(lián)用儀(GC-MS)的進(jìn)樣測(cè)定。

1.2 GC-MS分析

1.2.1  GC條件

    色譜柱：HP-5MS(30 mx0.25 mmx0.25 μm)彈性石英毛細(xì)管柱；載氣：He(99.999%)；恒流，柱流量：1.0mL/min；分流模式：不分流；進(jìn)樣量：1.0μL;進(jìn)樣口溫度：250℃；柱始溫60℃，保留0 min，程序升溫以8℃/min升至180℃，保持2min，程序升溫以7℃／min升至250℃，保持2 min;輔助加熱區(qū)2打開(kāi)，初始溫度280℃，方法總運(yùn)行時(shí)間為29 min。

1.2.2質(zhì)譜條件

    離子源：EI源；離子源溫度：230℃；四極桿溫度：150℃；色譜一質(zhì)譜連接口溫度：280℃；電子能量：70eV;電子倍增器電壓l 500 V;溶劑延遲時(shí)間：4 min;掃描方式：全掃描，掃描質(zhì)量數(shù)范圍是：35～400，閾值為200。

2結(jié)果與討論

    文章依據(jù)Palmqvist、Larsson、Heer、Klinke、Rasmussen等的研究基礎(chǔ)與分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分類(lèi)，將主要由木質(zhì)素降解產(chǎn)生的帶有酚結(jié)構(gòu)的物質(zhì)統(tǒng)稱(chēng)為酚類(lèi)，其中又可依據(jù)所含官能團(tuán)分為酚醛、酚酮、酚酸等，將主要來(lái)自于纖維質(zhì)的脂肪酸等簡(jiǎn)稱(chēng)為酸類(lèi)，將主要來(lái)自于纖維質(zhì)的呋喃衍生物（酸處理時(shí)為呋喃醛）稱(chēng)為呋喃類(lèi)，其它物質(zhì)根據(jù)各自官能團(tuán)進(jìn)行分類(lèi)。

2.1堿預(yù)處理前后稻草秸稈水解液中抑制物組成成

分分析

    對(duì)照組和經(jīng)過(guò)2%氫氧化鈉預(yù)處理的稻草秸稈水解液的總離子流色譜圖分別如圖1和圖2所示。每個(gè)濃度組設(shè)置3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，每個(gè)平行樣進(jìn)3針，圖庫(kù)檢索時(shí)每組去除非重復(fù)9次出現(xiàn)的幾種物質(zhì)。根據(jù)NIST11質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，對(duì)兩組水解液中的抑制物組成成分進(jìn)行鑒定，應(yīng)用峰面積歸一法確定各自的相對(duì)含量，分別如表l和表2所示，表中的保留時(shí)間指的是出峰時(shí)間，匹配度反應(yīng)的是每個(gè)峰的離子圖和NIST11圖庫(kù)中檢索到的已知標(biāo)準(zhǔn)物離子圖的相似度，匹配度達(dá)到80%即較為可信，每組匹配度選擇9個(gè)數(shù)據(jù)中的最小值；相對(duì)含量為每種物質(zhì)對(duì)應(yīng)峰積分面積占總積分面積的百分比，表中取9個(gè)相對(duì)含量數(shù)據(jù)的平均值；標(biāo)準(zhǔn)差是以上9個(gè)相對(duì)含量數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)差。每組的平行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示：不超過(guò)3種物質(zhì)在圖庫(kù)檢索時(shí)非重復(fù)出現(xiàn)，各平行實(shí)驗(yàn)中物質(zhì)保留時(shí)間相差小于0.2 min，大部分物質(zhì)相對(duì)含量的標(biāo)準(zhǔn)差較小，各組平行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)間不存在顯著差異。

2 .1.1對(duì)照組稻草秸稈水解液中抑制物組成成分

    共鑒定出對(duì)照組稻秸水解液中的23種抑制物，它們可以分為8個(gè)類(lèi)別。包括酚類(lèi)化合物3種，按相對(duì)含量排列分別為：香草醛>2，4-二叔丁基苯酚>丁香醛；酸類(lèi)化合物4種，分別為：十六烷酸(占大部分：14.90%)>己酸>苯甲酸>十八烷酸(0.92%)；酮類(lèi)化合物5種，分別為：4-羥基-3，5，5-三甲基-4-( 3-酮-1-丁烯基）-2-環(huán)己烯-1-酮>3-甲基-4-乙烯基-1H-吡咯-2，5-二酮>植酮>4-(2，6，6-三甲基-1，3-環(huán)己二烯-1-基)-3-丁烯-2 -酮>大馬士酮(0.90%)；烷烴類(lèi)化合物3種，分別為：正二十四烷（占大部分：29.89%）>正二十烷>正十九烷(0.59%)；呋喃類(lèi)化合物4種，分別為：二氫獼猴桃內(nèi)酯>2，3-二氫-2-甲基苯并呋喃>丙位己內(nèi)酯>丙位戊內(nèi)酯，后面2種低于1%；酰胺類(lèi)化合物1種，為N-丁基苯磺酰胺(4.58%)；萘類(lèi)化合物1種，為1，2，3，4-四氫一l，l，6-三甲基萘(0.64%)；此外還有酯類(lèi)化合物2種，分別為：鄰苯二甲酸二丁酯（占大部分：4.73%）>磷酸三丁酯(0.69%)。

2 .1.2經(jīng)過(guò)2%氫氧化鈉預(yù)處理的稻草秸稈水解液中抑制物組成成分

    共鑒定出經(jīng)堿預(yù)處理稻草秸稈水解液中的30種抑制物，它們可以分為6個(gè)類(lèi)別。包括酚類(lèi)化合物10種，按相對(duì)含量排列分別為：阿魏酸（占大部分：43.79%）>香草醛>乙酰丁香酮>2-甲氧基-4-乙烯基苯酚>丁香醛>對(duì)羥基苯甲醛>香草乙酮>2，4--叔丁基苯酚>4-乙基間苯二酚=水楊酸(0.1%)，后4種均低于1%；酸類(lèi)化合物8種，分別為：十六烷酸（占大部分：18.13%）>亞麻酸>亞油酸>十八烷酸>苯甲酸>十七烷酸>十五烷酸>十四烷酸，后面2種低于1%；酮類(lèi)化合物8種，其中巨豆三烯酮（占大部分：2.71%）>甲基環(huán)戊烯醇酮>植酮>大馬士酮>2，5-己二酮>3-甲基-2-環(huán)戊烯-1-酮>乙基環(huán)戊烯醇酮=環(huán)戊烷-1，2-二酮(0.09%)，后面7種均低于1%；呋喃類(lèi)化合物1種，為二氫獼猴桃內(nèi)酯(0.37%)；酰胺類(lèi)化合物2種，分別為：雙五亞甲基尿素>油酸酰胺，均低于1%；萘類(lèi)化合物1種，為l，2，3，4-四氫-1，1，6-三甲基萘(0.15%)。以上對(duì)于相對(duì)含量低于1%的物質(zhì)都有標(biāo)明。

2.2堿預(yù)處理前后稻草秸稈水解液中抑制物按類(lèi)別的組成成分對(duì)比及抑制作用分析

    由于水解液中物質(zhì)的復(fù)雜性，確定其中抑制物總質(zhì)量和各個(gè)成分的質(zhì)量存在很大困難，但可以借助各個(gè)處理組總離子流圖的總積分面積來(lái)近似描述抑制物總量，結(jié)合總離子流圖1、2中的物質(zhì)峰高和對(duì)照組總積分面積：( 3.97x108+3.90xl07)及堿預(yù)處理組總積分面積：( 6.07xl09+5.92xl08)，可知堿預(yù)處理組水解液中的總抑制物量是遠(yuǎn)多于對(duì)照組的，而且每個(gè)處理組的各平行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)之間不存在顯著差異：堿預(yù)處理前后稻秸水解液中抑制物經(jīng)分類(lèi)后的相對(duì)含量對(duì)比情況如圖3所示，從圖3可以看出：堿預(yù)處理前后水解液中抑制物組成成分有著極大地變化，對(duì)照組的水解液中各類(lèi)別物質(zhì)相對(duì)含量分布更均勻，按相對(duì)含量排列分別為：烷烴類(lèi)>酸類(lèi)>酮類(lèi)>酚類(lèi)>呋喃類(lèi)>酯類(lèi)>酰胺類(lèi)>萘類(lèi)；經(jīng)過(guò)堿預(yù)處理的水解液中酚類(lèi)和酸類(lèi)物質(zhì)占據(jù)94.46%的總相對(duì)含量，成為最主要的抑制物，而其它類(lèi)別物質(zhì)的相對(duì)含量相比對(duì)照組均大幅降低，其中各類(lèi)物質(zhì)按相對(duì)含量排列分別為：酚類(lèi)>酸類(lèi)>酮類(lèi)>酰胺類(lèi)>呋喃類(lèi)>萘類(lèi)，烷烴類(lèi)和酯類(lèi)物質(zhì)未檢測(cè)出；出現(xiàn)上述變化的主要原因可能是：NaOH溶液削弱纖維素和半纖維素間的氫鍵，引起木質(zhì)素和半纖維素間的酯鍵發(fā)生皂化，破壞本質(zhì)素結(jié)構(gòu)，進(jìn)而使得部分木質(zhì)素與纖維質(zhì)分解生成酚類(lèi)和酸類(lèi)物質(zhì)。下文結(jié)合表1與表2對(duì)水解液中各類(lèi)抑制物的抑制作用進(jìn)行分析。

2.2.1酚類(lèi)化合物

    酚類(lèi)化合物的抑制作用很強(qiáng)，小分子量的酚類(lèi)化合抑制作用最強(qiáng)。酚類(lèi)化合物能滲透到細(xì)胞膜內(nèi)，破壞細(xì)胞的完整性和活性，影響發(fā)酵微生物的正常生長(zhǎng)，甚至導(dǎo)致死亡。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，酚單體上的脂肪族官能團(tuán)取代基對(duì)酒精形成的抑制作用很明顯；而酮基、醛基、羧基等大部分取代基都加大其抑制作用。

    本研究中，經(jīng)過(guò)堿預(yù)處理的稻秸水解液中酚類(lèi)物質(zhì)種類(lèi)相比對(duì)照組從原來(lái)的3種增加到10種，經(jīng)過(guò)堿預(yù)處理后新出現(xiàn)了7種對(duì)照組未檢出的酚類(lèi)物質(zhì)，總相對(duì)含量相比對(duì)照組顯著增加，從原來(lái)的10.87%增長(zhǎng)至64.03%，增長(zhǎng)率達(dá)489.05%．3種共有酚類(lèi)物質(zhì)對(duì)比后發(fā)現(xiàn)丁香醛（減少率為10.5%）和2，4-二叔丁基苯酚（減少率為92.9%）減少，而香草醛卻有所增加（增長(zhǎng)率為10.8%）；新出現(xiàn)7種酚類(lèi)物質(zhì)中又以阿魏酸(43.79%)占主要組分，其次是乙酰丁香酮(6.63%)和2-甲氧基-4-乙烯基苯酚(3.14%)。從以上酚類(lèi)物質(zhì)的結(jié)構(gòu)可以看出，它們都含有酮基、醛基、羧基等官能團(tuán)，這些都很可能加大酚類(lèi)物質(zhì)對(duì)后續(xù)酒精發(fā)酵過(guò)程中酵母等的抑制作用。

2.2.2酸類(lèi)化合物

    酸類(lèi)物質(zhì)在發(fā)酵過(guò)程中對(duì)微生物的抑制作用主要表現(xiàn)在：有機(jī)酸分子以簡(jiǎn)單擴(kuò)散的方式穿過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入微生物細(xì)胞中，使細(xì)胞內(nèi)環(huán)境酸化，消耗并透支ATP從而抑制細(xì)胞生長(zhǎng)；Zaldivar等發(fā)現(xiàn)酸類(lèi)對(duì)菌體生長(zhǎng)的抑制作用隨pH的升高而減弱，并且酸類(lèi)疏水性強(qiáng)則其抑制作用也強(qiáng)。

    本研究中，檢測(cè)出的酸類(lèi)除苯甲酸外均為脂肪酸，而經(jīng)過(guò)堿預(yù)處理的稻秸水解液中酸類(lèi)物質(zhì)相對(duì)含量比對(duì)照組有所增加，從原來(lái)的21.04%增加到30.43%,增長(zhǎng)率為44.6%。酸類(lèi)物質(zhì)從原來(lái)的4種增長(zhǎng)到8種，其中3種是共有的酸類(lèi)物質(zhì)，3種酸類(lèi)物質(zhì)中十六烷酸（增長(zhǎng)率為21.7%）和十八烷酸（增長(zhǎng)率為120.7%）相對(duì)含量增加，而苯甲酸卻有所減少（減少率為31.8%）；經(jīng)過(guò)堿預(yù)處理的水解液中新增5種酸類(lèi)物質(zhì)，其中以亞麻酸(3.86%)和亞油酸(2.53%)占多數(shù)。但對(duì)照組的己酸(2.67%)在經(jīng)堿預(yù)處理后的水解液中未檢測(cè)出。十六（八）烷酸、亞麻酸、亞油酸等疏水性強(qiáng)，結(jié)合它們較大的相對(duì)含量可知：經(jīng)過(guò)堿預(yù)處理的稻秸水解液中酸類(lèi)物質(zhì)的抑制作用是相當(dāng)大的。

2.2.3其它類(lèi)物質(zhì)

    經(jīng)過(guò)堿預(yù)處理的水解液中除以上兩大類(lèi)物質(zhì)之外，酮類(lèi)、烷烴類(lèi)、呋喃類(lèi)、酰胺類(lèi)、萘類(lèi)、酯類(lèi)等物質(zhì)的含量及抑制作用均較弱。

    本研究中的酮類(lèi)均為脂肪酮或脂環(huán)酮，經(jīng)過(guò)堿預(yù)處理的稻秸水解液中酮類(lèi)（8種共4.31%）相比對(duì)照組（5種共18.54%）大幅下降，減少率為330.2%。烷烴類(lèi)物質(zhì)毒性相對(duì)較小，堿預(yù)處理后的水解液中未檢測(cè)出烷烴類(lèi)物質(zhì)。水解液中的呋喃類(lèi)物質(zhì)主要為呋喃酯類(lèi)，其毒性較低，相對(duì)含量從6.95%下降到0.37%。部分酰胺類(lèi)雖具有抗生素的作用，但是考慮到酰胺類(lèi)物質(zhì)可能產(chǎn)生于硫酸銨，而且相對(duì)含量從對(duì)照組的4.58%降到經(jīng)過(guò)堿預(yù)處理的0.7%，因而其毒性作用不深人探究。萘類(lèi)和酯類(lèi)相對(duì)含量分別從0.64%和5.42%降至0.15%和0%，可見(jiàn)，這兩類(lèi)物質(zhì)的抑制作用在經(jīng)堿預(yù)處理后均較低。

3結(jié)論

    (1)經(jīng)過(guò)堿預(yù)處理的水解液中檢測(cè)出的抑制物為6類(lèi)30種，對(duì)照組為8類(lèi)23種；經(jīng)過(guò)堿預(yù)處理后抑制物種類(lèi)增多，但集中于少數(shù)幾類(lèi)物質(zhì)，對(duì)照組抑制物種類(lèi)少但較為分散。

    (2)經(jīng)過(guò)堿預(yù)處理的水解液中酚類(lèi)和酸類(lèi)物質(zhì)種類(lèi)比對(duì)照組明顯變多，酚類(lèi)物質(zhì)種類(lèi)從3種增加到10種，酸類(lèi)物質(zhì)種類(lèi)從4種增加到8種；相對(duì)含量相比對(duì)照組顯著增加，分別從10.87%及21.04%增長(zhǎng)至64.03%及30.43%，同時(shí)由于這2類(lèi)物質(zhì)相對(duì)大的毒性，使得它們成為最優(yōu)處理?xiàng)l件下的水解液中的主要抑制物。因而，對(duì)于酚類(lèi)和酸類(lèi)物質(zhì)的去除是稻草秸稈生產(chǎn)燃料乙醇工藝中消除發(fā)酵抑制作用的關(guān)鍵。其中，酚類(lèi)中的阿魏酸(43.79%)和酸類(lèi)中的十六烷酸(18.13%)

含量最高，應(yīng)考慮重點(diǎn)去除。其次，應(yīng)該考慮去除的可能有乙酰丁香酮(6.63%)、2-甲氧基-4乙烯基苯酚(3.14%)、亞麻酸(3.86%)和亞油酸(2.53%)和巨豆三烯酮(2.71%)等。

(3)2% NaOH堿預(yù)處理對(duì)于稻秸水解液中抑制物組成成分和抑制作用產(chǎn)生了極大的影響，從總抑制物量、酚類(lèi)和酸類(lèi)的相對(duì)含量以及它們的毒性等綜合看來(lái)，其水解液中抑制物總抑制作用很可能強(qiáng)于對(duì)照組。  

4 摘要：

采用萃取濃縮一氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)( EE-GC/MS)對(duì)未經(jīng)堿預(yù)處理與經(jīng)過(guò)2% NaOH堿預(yù)處理的稻草秸稈水解液中抑制物組成成分進(jìn)行了研究，旨在為解決堿預(yù)處理對(duì)木質(zhì)纖維素原料生產(chǎn)燃料乙醇過(guò)程的抑制作用提供理論支持。研究結(jié)果表明，經(jīng)過(guò)堿預(yù)處理的稻秸水解液中檢測(cè)出抑制物種類(lèi)共6類(lèi)30種，對(duì)照組共8類(lèi)23種。其中，經(jīng)過(guò)堿預(yù)處理的水解液中酚類(lèi)和酸類(lèi)物質(zhì)種類(lèi)比對(duì)照組明顯增多，酚類(lèi)物質(zhì)種類(lèi)從3種增加到10種，酸類(lèi)物質(zhì)種類(lèi)從4種增加到8種；相對(duì)含量亦比對(duì)照組顯著增加，酚類(lèi)物質(zhì)的相對(duì)含量從10.87%增長(zhǎng)至64.03%，酸類(lèi)物質(zhì)的相對(duì)含量從21.04%增加到30.43%，成為最優(yōu)堿預(yù)處理?xiàng)l件下的水解液中的主要抑制物，其中阿魏酸和十六烷酸相對(duì)含量最高，分別為43.79%及18 .13%；此外，其它類(lèi)別的物質(zhì)相對(duì)含量均大幅降低。綜合看來(lái)，經(jīng)過(guò)堿預(yù)處理的水解液中抑制物總抑制作用強(qiáng)于對(duì)照組。