關于響應面優(yōu)化法提取白簕總多酚及抗氧化能力的探索
作者：胡曉輝
白筋(Acanthopanax trifoliatus(L．)Merr)，又稱鵝掌、三葉五加、筋菜等，為五加科五加屬灌木植物；白簕為傳統(tǒng)的民間藥食同源植物，國內廣泛分布于廣東、四川、貴州、臺灣等地，日本、越南和菲律賓亦有。白簕含有黃酮、多酚、皂苷、揮發(fā)油、多糖等活性成分�！睹�·食物本草》記載：“五加，葉作蔬食，去皮膚風濕”，《中國高等植物圖鑒》記載： “簕菜味苦、辛、涼，具有清熱解毒、祛風利濕、舒筋活血、止咳平喘之功效”。試驗對簕菜進行了深入系統(tǒng)的研究，分離一系列活性成分，前期活性研究結果表明白筋提取物具有很好的抗氧化、抗炎和抗腫瘤活性。近年來對植物多酚的大量研究表明，多酚具有很好的抗氧化活性。試驗首次以白筋莖葉為研究對象，對白簕總多酚的提取工藝進行優(yōu)化并研究其抗氧化活性，為白簕的開發(fā)利用提供科學理論依據。
1 材料與儀器
白筋：由廣東恩平李雪壯筋菜茶廠種植基地提供，5月采收，經廣東省廣州市華南植物園葉華谷研究員鑒定為五加科植物白簕。沒食子酸標準品、水溶性維生素E( Trolox)標準品、福林-酚試劑(FC)、
1，1--苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、2，2-聯(lián)氮一二3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽(ABTS)、2，4．6-三吡啶基三嗪(TPTZ)、2，2’-偶氮二（2-脒基丙烷）二鹽酸鹽( AAPH)：Sigma公司；其他試劑均為分析純：廣州化學試劑廠。
Lambda 25紫外-可見分光光度計：珀金埃爾默（上海）有限公司；Tecan Infinite F200 PRO-濾光片型多功能酶標儀：帝肯（上海）貿易有限公司；HH-S型水浴鍋：鄭州長城科工貿易有限公司； ML204/02型電子天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。
2試驗方法
2.1 白簕總多酚含量和提取率的測定
精密稱量4 mg沒食子酸，用水溶解定容至100 mL，分別移取0，0.125，0.250, 0.500, 0.750, 1.000和1.200 mL于0～6號10 mL具塞試管中，用去離子水定容到2 mL，加入0.25 mL稀釋1倍的福林酚試劑，靜置6 min后，加入2.5 mL的7% Na2C03溶液，用去離子水定容到6 mL，室溫靜置90 min后以0號試管作為空白參照，于760 nm測其吸光度。以吸光度為y值；以沒食子酸標準品質量濃度( mg/L)為x值，繪制標準曲線。線性回歸方程為：
y=0.105 6x-0.001 5(R2=0.999 5).
測定各提取液吸光度，并根據回歸方程計算白簕總多酚得率（以沒食子酸計）。
M=C×V×N/m×100% (1)
式中：M-白筋總多酚得率，mg/g; C-根據標準曲線計算出待測液中總多酚含，mg/mL; V-待測液體積，mL; N-稀釋倍數(shù)；m-白簕于粉質量，g。
2.2 白筋總多酚的提取工藝研究
取新鮮白簕莖葉經清洗，瀝水后，50℃下干燥至恒重，粉碎，過60目篩，精密稱取白簕粉2g，按一定液料比值例加入乙醇溶液，加熱恒溫提取一定時間，減壓抽濾后定容到50 mL的容量瓶中備用。首先，對乙醇體積分數(shù)（15%，35%，55%，75%和95%），提取時間（30，60，120，180和240 min），提取溫度（50 0C，60 0C，70 0C，80℃和90℃）和液料比值（10，15，20，25和30（mL/g））進行單因素考察。然后以乙醇體積分數(shù)、提取時間、提取溫度和液料比值為考察因素，采用Design Expert軟件的Box-Behnken模型響應面方法進行四因素三水平試驗，因素水平表見表1。
2.3體外抗氧化活性測定
2.3.1 DPPH自由基清除能力
白筋多酚提取液和標準品Trolox母液分別稀釋成合適的濃度梯度，吸取不同濃度的白簕多酚提取液和Trolox溶液2 mL，加入2 mL已配好的DPPH溶液(0.16 mmol/L)，混合搖勻作為試驗組，以2 mL無水乙醇加入2 mL DPPH溶液作為空白對照。室溫放置暗處30 min后，在517 nm處測定吸光度，計算清除率。
DPPH自由基清除率=（1-A試驗組/A空白組）×100%
(2)
2.3.2 ABTS自由基清除能力
白簕多酚提取液和標準品Trolox母液分別稀釋成合適的濃度梯度，吸取不同濃度的白筋多酚提取液和Trolox溶液400 uL樣液加入3.6 mL ABTS溶液，混勻作為試驗組，以無水乙醇作為空白對照。30 aC水浴鍋中反應6min，于波長734 nm下測其吸光度，計算清除率。
ABTS自由基清除率=（1-A試驗組/A 空白組）×100%
(3)
2.3.3 0RAC抗氧化能力
參照文獻的方法測定，并進行適當修改。白簕多酚提取液和標準品Trolox溶液用75 mmol/L磷酸鹽緩沖液( pH 7.4)進行稀釋。取20uL適當濃度的白筋多酚提取液或者20 uL標準品Trolox溶液(5～50 umol/L)，和120uL 熒光素鈉溶液(136 nmol/L)加入96孔酶標板中，在熒光酶標儀中于37 0C溫育20 min，每個孔再加入60 uLAAPH溶液(40 mmol/L)，短時振蕩后在波長485 nm處激發(fā)，每2 min在波長535 nm處釋放測定熒光強度，設置測定時間120 min。ORAC抗氧化能力以每毫克提取物的多酚對應的Trolox當量表示
( mg TE/mg)。
3結果與分析
3.1單因素試驗結果與分析
分別選擇乙醇體積分數(shù)、提取時間、提取溫度和液料比值為因素，單因素試驗分析白筋總多酚得率結果如圖1。
由圖1 (a)可知，固定其他因素，乙醇體積分數(shù)在15%~55%時，提取得率呈升高趨勢達到54.85 mg/g，總多酚得率隨乙醇體積分數(shù)增加而增加，由于多酚在植物體內通常與蛋白質，多糖以氫鍵和疏水鏈形成穩(wěn)定的分子復合物，而乙醇通過斷裂氫鍵作用，提高總多酚得率。在55%～95%時呈降低趨勢，提取液中溶出較多醇溶性雜質和親脂性強的化合物，這些化合物與多酚類物質競爭乙醇分子，并且組織的通透性下降，導致多酚得率下降。
從圖1 (b)可知，固定其他因素，隨提取時間的增大，白筋總多酚得率先增加后減小，在120 min時達到最大值58.50 mg/g。由于大分子物質氫鍵和疏水作用力的破壞需要時間，在一定范圍內，總多酚得率隨提取時間的增加而增多。提取時間過長時，多酚與氧氣接觸而分解或乙醇揮發(fā)而極性降低，總多酚得率減少。
從圖1 (c)可知，固定其他因素，白筋總多酚得率隨提取溫度的增加先升高后降低，在70℃時達到最大值56.35 mg/g，隨后溫度升高，得率反而降低。在較低溫度范圍內，醇溶液中多酚運動速度隨溫度升高而增大，加速其從細胞中溶出而提取得率提高，但是溫度過高會破壞多酚的結構，乙醇也會加速揮發(fā)而不利于提取。
從圖1 (d)可知，固定其他因素，隨液料比值的增大，白筋總多酚得率變大，說明增大溶劑比例，有利于多酚的溶出，提高總多酚得率，當液料比值達到25（mL/g）時，總多酚得率趨于穩(wěn)定，多酚物質已溶出完全。
3.2 Box-Behnken設計試驗結果與分析
利用Design-Expert 8.0.6軟件，對白筋總多酚得率顯著影響因素進行響應面分析，Box-Behnken試驗設計及結果見表2，得到白筋總多酚得率(Y)對乙醇體積分數(shù)(A)、提取溫度(B)、提取時間(C)和液料比值(D)的多元二次回歸模型方程式：
Y=61.95+0.3 8A+3.80B-0.57C-0.034D+0.35AB+0.50AC+
0.078AD+0.43 BC+O.10BD+1.49CD-2.79A2-3.44B2-0.83C2-1.84D2。
利用Design-Expert 8.0.6軟件對試驗結果進行響應面分析，得出回歸模型參數(shù)的方差分析見表3。由方差分析可知，模型的p值顯著，模型的相關系數(shù)R2=0.994 2，失擬項(p=0.457 1>0.100 0)不顯著，說明該方程與試驗的擬合度好。其中，極顯著項(p<0.01)有A, B, C, CD, A2, B2, C2, D2。顯著項(p<0.05)有AC，BC，在所選取的各因素水平范圍內，單因素的影響順序為提取溫度(B)>提取時間(C)>乙醇體積分數(shù)(A)>液料比值(D)。各因素交互作用中，三組變互項CD，AC和BC對Y有顯著影響(p<0.05)，其中CD對Y影響極為顯著( p<0.001)，圖2～4分別對應其響應面圖和等高線圖，從圖中可直觀地反映出這三組交互項之間對總多酚得率存在比較顯著的交互作用。
3.3最佳條件的確定及驗證試驗
由Design-Expert 8.0.6軟件分析得，當乙醇體積分數(shù)為55.35%，溫度為74.79℃，提取時間為113.31 min，液料比值為25.05( mL/g)時，白筋總多酚得率的預測值為63.01 mg/g。結合實際情況確定白筋總多酚的提取工藝條件：乙醇體積分數(shù)為55%，溫度為75℃，提取時間為113 min，液料比值為25( mL/g)，以此條件進行提取，重復3次試驗，得到總多酚得率的實際值為62.71±1.48 mg/g，該值與理論預測值基本吻合，說明該模型具有較好的分析能力，證實試驗優(yōu)化得到的工藝參數(shù)基本可靠，重現(xiàn)性較好。
3.4 白簕總多酚的抗氧化活性評價
由圖5可見，白筋總多酚和Trolox的自由基清除能力呈現(xiàn)明顯的濃度依賴性，兩者對DPPH自由基清除的IC50值分別為5.33 ug/mL(y=9.460 7x-0.424 4，R2=0.997 5)和4.63 ug/mL(y=10.809x-0.002 1,R2=0.999 0)，說明白筋總多酚DPPH自由基清除能力接近Trolox，而對ABTS自由基清除的IC50值分別為6.60ug/mL(y=8.503 3x-6.136 6.R2=0.996 7)和10.03ug /
mL（y=4.919 8x+0.672 1，R2=0.997 7），結果表明白筋總多酚ABTS自由基清除能力高于Trolox。此外，ORAC抗氧化能力標準曲線(y=1.292 Sx+3.384 1，R2=0.997 0，其中y為凈面積，x為Trolox質量濃度)，測定出白簕總多酚的ORAC抗氧化能力為1.30±0.31 mg TE/mg。三種活性評價結果表明，白筋總多酚成分具有和Trolox相當甚至更好的抗氧化活性，用于食品品質維持和功能食品開發(fā)前景廣闊。
4結論
運用Design-Expert 8.0.6軟件優(yōu)化乙醇體積分數(shù)，提取溫度，提取時間和液料比值對白簕總多酚得率的影響，得到最優(yōu)提取條件：乙醇體積分數(shù)為55%，溫度為75℃，提取時間為113 min，液料比值為25（mL/g）。在此條件下，白簕總多酚得率的實際值為62.71±1.48 mg/g，該值與理論預測值63.01 mg/g基本吻合。響應面法所得的優(yōu)化提取條件工藝參數(shù)可靠，可行性強，可為白簕多酚產品的開發(fā)利用提供科學依據。通過DPPH，ABTS和ORAC方法的活性評價結果表明，最優(yōu)提取條件下白簕總多酚具有較強的抗氧化活性。
5摘要
以白簕為原料，研究白簕總多酚的提取工藝，并研究其抗氧化活性。在單因素基礎上，采用Box-Behnken響應面法對提取工藝進行優(yōu)化，所得最佳工藝參數(shù)：乙醇體積分數(shù)為55%，溫度為75℃，提取時間為113 min,液料比值為25 (mL/g)。買際測得總多酚得率62.71±1.48 mg/g，與理論值基本吻合。通過DPPH, ABTS和ORAC測定的研究結果表明，白簕總多酚具有與Trolox相當甚至更好的抗氧化活性。
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