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    作者：鄭曉敏

     木聚糖酶在造紙工業(yè)、飼料行業(yè)、保健品和能源行業(yè)均具有很好的應(yīng)用前景。木聚糖酶可取代有毒的化學(xué)物質(zhì)，減少紙漿工序漂白過程中氯的用量：木聚糖酶對植物細(xì)胞壁半纖維素部分有降解作用，在飼料行業(yè)可提高營養(yǎng)成分利用率，改變動物的消化道形態(tài)，提高內(nèi)源消化酶的活力，促進(jìn)雙歧桿菌增殖：更為重要的是，木聚糖酶可以提高木質(zhì)纖維素乙醇生中纖維素的糖化率。隨著石油、煤炭等化石資源的日益緊張和環(huán)境壓力的加劇，開發(fā)高效低成本的木聚糖酶具有非常重要的意義。

    目前發(fā)酵工程研究正向精細(xì)化、自動化多目標(biāo)方向發(fā)展，有利于過程強(qiáng)化，降低生產(chǎn)成本。主要通過發(fā)酵動力學(xué)研究，獲取發(fā)酵參數(shù)，建立數(shù)學(xué)模型，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)發(fā)酵過程的計(jì)算機(jī)在線控制：目前．國內(nèi)外學(xué)者的主要研究集中在培養(yǎng)基的搖瓶實(shí)驗(yàn)，關(guān)于液態(tài)發(fā)酵制備木聚糖酶的報(bào)道卻很少 。 勇強(qiáng)采用分批和分批補(bǔ)料培養(yǎng)兩種方式，在搖瓶中對合成低纖維素酶酶活的木聚糖酶進(jìn)行了研究．經(jīng)過3次補(bǔ)料，分批補(bǔ)料的酶產(chǎn)率遠(yuǎn)高于分批發(fā)酵。利用康寧木霉開展了分批發(fā)酵生產(chǎn)木聚糖酶的動力學(xué)模型研究。何志明在10 L發(fā)酵罐中對甘路聚糖酶分批發(fā)酵動力學(xué)過程進(jìn)行了研究，但對其發(fā)酵過程控制研究未見報(bào)道。本文在30 L德國貝朗Cplus30發(fā)酵罐上，對木聚糖酶的發(fā)酵過程進(jìn)行了詳細(xì)的動力學(xué)研究，并提出了分批補(bǔ)料發(fā)酵控制策略，以期得到酶活高、生產(chǎn)能力強(qiáng)的木聚糖酶工藝。

1材料與方法

1.1材料與儀器

1.1.1菌種

    里氏木霉（Trich.oderma reesei）由艾倫麥克德爾米德再生能源研究所提供。

1.1.2培養(yǎng)基

    斜面培養(yǎng)基：即PDA培養(yǎng)基。

    種子培養(yǎng)基：木糖20 g/L，酵母膏20 g/L，(NH4)2S04 0.5 g/L,NaN03 0.5 g/L。

    發(fā)酵培養(yǎng)基：乳糖45.13 g/L，玉米漿15.94g/L，(NH4)2S04 3g/L,KH2P04 2.73 g/L,MgS04-7H20

 0.8 g/L，無水CaCl2 0.6 g/L，吐溫-80 1 mL/L。

1.1.3儀器與設(shè)備

    Biostat Cplus30發(fā)酵罐：廣州寶信捷生物應(yīng)用設(shè)備有限公司：DYNAIR型空氣壓縮機(jī)：上海岱洛工貿(mào)有限公司：BPC-250F型恒溫培養(yǎng)箱：上海一恒科技有限公司；ZQLY- 180型振蕩培養(yǎng)箱：上海趙迪生物科技有限公司；SW-CT-1D型凈化工作臺：蘇州凈化設(shè)備有限公司：UV-2000型紫外分光光度計(jì)：尤尼柯（上海）儀器有限公司；AR2140型分析天平：梅特勒一托利多儀器（上海）有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法  

1.2.1發(fā)酵動力學(xué)方程的構(gòu)建

  1.2.1.1菌體生長動力學(xué)方程

    Logistic方程是典型的S型曲線，能夠很好地反應(yīng)分批發(fā)酵中菌體的生長。將其應(yīng)用到里氏木霉產(chǎn)木聚糖酶的菌體生長中，其Logistic方程為

  式中：X為菌體生物量，g/L；um菌體最大比生長速率，h-1；Xmax為菌體最大生物量，g/L。

    當(dāng)初始條件t=0，X=X0時，將式(1)對時間t積分，經(jīng)過一系列積分變換得到菌體生物量X關(guān)于時間t的函數(shù)：

式中：X0為初始生物量，g/L。利用Origin8.5作非線性擬合，求得式中參數(shù)X0，Xmax和um。

1.2.1.2產(chǎn)物形成動力學(xué)方程

    發(fā)酵產(chǎn)物的形成分為3種類型：I型產(chǎn)物形成與細(xì)胞生長相耦聯(lián)；II型產(chǎn)物形成與細(xì)胞生長部分耦聯(lián)：III型產(chǎn)物形成與細(xì)胞生長沒有聯(lián)系。Luedekingand Piret對此進(jìn)行了總結(jié)，得到著名的Luedeking-Piret方程：

式中：a和B為動力學(xué)模型參數(shù)，右側(cè)第一項(xiàng)表示與菌體生長率相關(guān)的產(chǎn)物形成率；BX是與非伴隨菌體生長的產(chǎn)物形成率。

    當(dāng)a≠0，B=o時，產(chǎn)物形成與細(xì)胞生長偶聯(lián)型；當(dāng)a=0，B≠0時，產(chǎn)物形成與細(xì)胞生長非偶聯(lián)型；當(dāng)a≠0，B≠0時，產(chǎn)物形成與細(xì)胞生長部分偶聯(lián)型。

    當(dāng)t=0，P=P0，X=X0時，將式(3)對時間t積分，經(jīng)過一系列積分變換得到產(chǎn)物形成P關(guān)于時間t的函數(shù)：

式中：P0為零時刻的酶活，U/mL 。利用Origin8.5作非線性擬合，求得式中參數(shù)a，B和P0。

1.2.1.3基質(zhì)消耗動力學(xué)方程

    在發(fā)酵過程中，基質(zhì)的消耗主要有3個方面：用以新細(xì)胞生長的消耗：細(xì)胞維持基本生命活動的消耗：生成代謝產(chǎn)物的消耗[10]�；�質(zhì)消耗動力學(xué)模型通常用下式表示：

式中：Yx/s為最大細(xì)胞得率；Yp/s為產(chǎn)物的得率常數(shù)：m為細(xì)胞的維持系數(shù)，g/(g-h)或h-1。

    當(dāng)初始條件t=0，X=X0，S=S0時，將式(5)對時間t積分，經(jīng)過一系列積分變換得到基質(zhì)消耗S關(guān)于時間t的函數(shù)：

式中：S0為初糖濃度，g/L。利用OI-igin8.5作非線性擬合，求得式中參數(shù)S0，Yx/s，Yp/s和m。

1.2.2分批補(bǔ)料發(fā)酵的研究

1.2.2.1發(fā)酵動力學(xué)實(shí)驗(yàn)及參數(shù)測定

    通過溶氧與攪拌聯(lián)動并配合通風(fēng)比的調(diào)節(jié)，將菌體對數(shù)生長期時的溶氧均設(shè)置為15%，后期控制為45%。裝液量為10 L，滅菌結(jié)束后，按10%的接種量接種，恒定28 0C培養(yǎng)。每6h取樣一次，對生物量、酶活、殘?zhí)呛桶被�氮等離線數(shù)據(jù)進(jìn)行測量，并整合在線測量數(shù)據(jù)pH和溶氧進(jìn)行作圖并分析，獲取動力學(xué)參數(shù)。

1.2.2.2生物量和產(chǎn)酶特性研究

    在許多微生物發(fā)酵和培養(yǎng)過程中控制碳源濃度是實(shí)現(xiàn)過程優(yōu)化的關(guān)鍵。在發(fā)酵過程中流加補(bǔ)入碳源可以控制微生物的中間代謝，使發(fā)酵向著有利于產(chǎn)物積累的方向發(fā)展，并可以根據(jù)具體情況，通過實(shí)驗(yàn)研究確定最合適的控制方法。

    本實(shí)驗(yàn)采用前后期分段補(bǔ)料的方法，前期依據(jù)已有數(shù)據(jù)及發(fā)酵動力學(xué)方程，補(bǔ)入適量的培養(yǎng)基，進(jìn)一步促使菌體大量生長：后期通過流加培養(yǎng)基，控制恒定的pH，使得菌體呈現(xiàn)“半饑餓”狀態(tài)，持續(xù)誘導(dǎo)產(chǎn)酶，提升酶的產(chǎn)量。以此來研究分批發(fā)酵和分批補(bǔ)料發(fā)酵在生物量和產(chǎn)酶上的變化特征。

2結(jié)果與分析

2.1發(fā)酵動力學(xué)方程參數(shù)測定與構(gòu)建

    根據(jù)1.2.1的方法，研究里氏木霉分批發(fā)酵過程中菌體生長的動力學(xué)特征，繪制動力學(xué)曲線，通過擬合曲線，得出各種動力學(xué)參數(shù)，結(jié)果見表1。

將表1所得結(jié)果帶入式(2)，(4)和(6)中并整理，得到以下3個方程。

菌體生長動力學(xué)方程：

    通過對菌體生長曲線擬合表明，除生物量峰值附近的點(diǎn)偏離擬合曲線較遠(yuǎn)外，其他點(diǎn)均緊湊的分布于曲線附近二擬合曲線R2=0.940 38,表明94.038%的數(shù)據(jù)都可以用此模型解釋，菌體生長曲線模型擬合得很好。

產(chǎn)物合成動力學(xué)方程：

通過對產(chǎn)物形成曲線的擬合表明，發(fā)酵初期擬合值與實(shí)際值偏離較大,48—120 h的點(diǎn)均分布在擬合曲線附近。結(jié)合菌體生長曲線和產(chǎn)物曲線看，從發(fā)酵開始，生物量和酶活都迅速增長，但48h后生物量不再增加，而酶活仍然持續(xù)增加。所以，里氏木霉的生長和木聚糖酶的形成為部分偶聯(lián)型。這與表1參數(shù)求解結(jié)果中a和B均不等于零相吻合。擬合曲線R2=0.850 71,表明85.071%的數(shù)據(jù)都可以用此模型解釋，產(chǎn)物形成曲線模型擬合得較好。

底物消耗動力學(xué)方程：

    通過對底物消耗曲線的擬合發(fā)現(xiàn)，整個發(fā)酵過程除前24 h和72 h附近的點(diǎn)偏離擬合曲線較遠(yuǎn)外，其余絕大多數(shù)點(diǎn)都緊湊的分布于擬合曲線附近。擬合曲線R2=0.956 68，表明95.668%的數(shù)據(jù)都可以用此模型解釋，底物消耗曲線模型擬合得很好。

    為了驗(yàn)證模型的適用性，以相同的發(fā)酵條件重復(fù)上一次實(shí)驗(yàn)，測定生物量、酶活和殘?zhí)�，并將�?shí)驗(yàn)值與擬合值對比，計(jì)算二者之間的誤差。擬和值與實(shí)際分批發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。在發(fā)酵前12 h實(shí)驗(yàn)值和擬合值的誤差偏大，之后除第42 h和第48 h兩個點(diǎn)外，其他時間的實(shí)驗(yàn)值與擬合值的誤差均在10%以內(nèi)。在發(fā)酵前期和末期酶活的實(shí)驗(yàn)值偏離擬合值稍大，其余時間絕大部分點(diǎn)的誤差均在10%以內(nèi)。殘?zhí)堑南�耗在整個發(fā)酵過程中除末期的實(shí)驗(yàn)值與擬合值偏差較大以外，其余絕大多數(shù)時間點(diǎn)的誤差均在10%以內(nèi)。

    總體來說，菌體生長曲線和底物消耗曲線擬合得很好，產(chǎn)物形成曲線擬合得較好，3個方程均可以用來預(yù)測發(fā)酵過程中生物量、酶活和殘?zhí)请S時間的變化情況，可以作為分批補(bǔ)料發(fā)酵的依據(jù)。

2.2分批補(bǔ)料發(fā)酵方案的確定

    通過已有的數(shù)據(jù)總結(jié)出一個規(guī)律，生物量的增長總是在42 h左右以后趨緩．48 h左右達(dá)到最大值，發(fā)酵液的pH總是呈現(xiàn)先上升后下降然后緩慢上升的趨勢。在發(fā)酵至42 h時，發(fā)酵液的pH下降至3.4左右，此后pH繼續(xù)下降。產(chǎn)酶達(dá)到頂峰時的殘?zhí)菨舛仍?0 g/L左右，此時發(fā)酵液的pH剛好回升至3.4。

    根據(jù)以上規(guī)律，設(shè)計(jì)分批補(bǔ)料發(fā)酵方案：溶氧控制仍然與攪拌聯(lián)動，前期使其自然下降，對數(shù)期控制在15%，后期控制在45%。發(fā)酵42 h起開始補(bǔ)料，補(bǔ)充發(fā)酵42—72 h菌體消耗的底物，將這30 h分為5個時間段，每個時間段為6h，由于每個時間段菌體消耗底物的速率不同，故依據(jù)底物消耗動力學(xué)方程，計(jì)算出每個時間段的補(bǔ)料速率。判斷補(bǔ)料時機(jī)的準(zhǔn)則：發(fā)酵42 h時觀察發(fā)酵液的pH是否降至3.4，測定此時的殘?zhí)菨舛�，如果濃度�?0 g/L左右，即開始補(bǔ)料。本實(shí)驗(yàn)利用了貝朗Biostat Cplus30的Profile動態(tài)補(bǔ)料程序功能，整個變速補(bǔ)料過程自動控制。表3為補(bǔ)料培養(yǎng)基配方，表4為各時段補(bǔ)料速率。

2.3分批發(fā)酵與分批補(bǔ)料發(fā)酵各參數(shù)的變化規(guī)律

圖1為分批補(bǔ)料發(fā)酵后各參數(shù)隨時間的變化

規(guī)律。由圖可知，從發(fā)酵開始生物量迅速增長．66 h達(dá)到最大值(20.86g/L)，與不補(bǔ)料時的最大生物量相比，增加了6%，之后菌體生物量并未迅速下降，一直維持穩(wěn)定直到發(fā)酵結(jié)束。補(bǔ)料使得整體生物量得到了一定提高，避免了菌體的過早衰亡：從發(fā)酵開始酶活也迅速增長，96 h后增長速度雖減慢，但仍然以較快而穩(wěn)定的速率增長，直至162 h達(dá)到最大(2 406.175 U/mL，其單位質(zhì)量蛋白酶活為6 573 U/mg)。從發(fā)酵開始?xì)執(zhí)蔷捅谎杆倮�用，由�?2 h時開始補(bǔ)料，殘?zhí)堑南陆第厔葑兙彛?4～66 h時菌體剛開始適應(yīng)由于補(bǔ)料而引起的發(fā)酵環(huán)境變化，致使菌體利用殘?zhí)堑乃俾市∮谠摃r段物料的流加速率，造成該時間段的殘?zhí)浅霈F(xiàn)上 升的趨勢。此后殘?zhí)窃俣缺谎杆倮�用，直至酶活達(dá) 到最大以后殘?zhí)侨匀槐痪�體迅速利用。pH仍然呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，84 h達(dá)到最低值，之后開始緩慢上升。補(bǔ)料后的最低pH值比不補(bǔ)料時低，可見補(bǔ)料后進(jìn)一步加大了有機(jī)酸的積累。氨基氮也呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢,120 h時降到最低，之后緩慢上升。由于補(bǔ)料，氨基氮的利用時間推遲了60 h左右。在溶氧與攪拌聯(lián)動的情況下，攪拌轉(zhuǎn)速的變化其實(shí)反應(yīng)了菌體呼吸強(qiáng)度的變化，由圖可知，從發(fā)酵開始，攪拌轉(zhuǎn)速迅速增大，表明菌f本大量生長，呼吸強(qiáng)度持續(xù)增大。32 h后攪拌轉(zhuǎn)速開始下降，表明菌體的呼吸強(qiáng)度開始減弱，但42 h開始補(bǔ)料后，攪拌速度再次增大，表明菌體攝取到新補(bǔ)人的培養(yǎng)基后，呼吸強(qiáng)度再次增大。之后攪拌轉(zhuǎn)速逐漸下降，90 h后下降幅度變慢�？梢钥闯觯�補(bǔ)料后，菌體在后期衰亡減慢，維持了菌體活性，專提升酶的產(chǎn)量提供了保障。

    圖2所示為分批發(fā)酵與分批補(bǔ)料發(fā)酵生物量隨時間變化的對比。由圖可知，從發(fā)酵開始—48 h．二者的生物量接近，48 h時二者生物量幾乎相同。4h后分批發(fā)酵的生物量開始下降，而分批補(bǔ)料發(fā)酵的生物量繼續(xù)上升，至66 h達(dá)到最大，此后維持平穩(wěn)沒有明顯下降趨勢。補(bǔ)料使得發(fā)酵過程的整體生物量得到了一定的提升，避免了菌體的過早衰亡，使發(fā)酵時間可延長到160多h。

    圖3所示為分批發(fā)酵與分批補(bǔ)料發(fā)酵酶活隨時間變化的對比。由圖可知，從發(fā)酵開始一直到120 h二者的酶活幾乎一致。120 h后分批發(fā)酵的酶活開始下降，而分批補(bǔ)料發(fā)酵的酶活仍然持續(xù)上升，直至162 h達(dá)到最大值。由此可知，補(bǔ)料使得整個發(fā)酵過程中菌體生物量提升了一定水平外，也延長了酶的積累時間，提高了酶的產(chǎn)量和酶的生產(chǎn)效率。

  3結(jié)論

本文在發(fā)酵罐上針對里氏木霉發(fā)酵產(chǎn)木聚糖酶的工藝進(jìn)行了研究，構(gòu)建了關(guān)于菌體生長、產(chǎn)物形成和底物消耗的發(fā)酵動力學(xué)方程，并依據(jù)發(fā)酵動力學(xué)方程設(shè)計(jì)了補(bǔ)料方案，進(jìn)行了分批補(bǔ)料發(fā)酵研究。研究結(jié)果表明，分批補(bǔ)料發(fā)酵可提高發(fā)酵過程整體的生物量，避免了菌體過早衰亡，延長了酶的生產(chǎn)時間，可將酶活提升到2 406.175 U／mL，其單位質(zhì)量蛋白酶活為6 573 U/mg，為工業(yè)自動化控制生產(chǎn)奠定了良好基礎(chǔ)。

4摘要：

在里氏木霉發(fā)酵產(chǎn)木聚糖酶工藝研究基礎(chǔ)上，構(gòu)建了關(guān)于菌體生長、產(chǎn)物形成和底物消耗的發(fā)酵動力 學(xué)方程，并依據(jù)發(fā)酵動力學(xué)過程特點(diǎn)設(shè)計(jì)了分批補(bǔ)料方案，研究r分批補(bǔ)料發(fā)酵過程中生物量、pH值、氨基氮、酶量等參數(shù)的變化特征。研究結(jié)果表明，分批補(bǔ)料發(fā)酵可提高發(fā)酵過程的生物量，避免菌體過早衰亡，在120 h后分批補(bǔ)料發(fā)酵可以延長菌體產(chǎn)酶時間，提高單位發(fā)酵體積的發(fā)酵酶活，為工業(yè)自動化控制生產(chǎn)奠定良好基礎(chǔ)。