基于 PCA ，關(guān)于新疆沙漠果油抗氧化能力的探索
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作者：鄭曉敏
衰老通常指機體生長發(fā)育成熟之后，機體的生理功能逐漸下降，組織器官逐漸發(fā)生退行性的改變，最后走向死亡的過程 [1]。自由基是對核酸、蛋白質(zhì)、糖類以及生物膜造成傷害導(dǎo)致機體損傷[1]，其中超氧陰離子自由基、脂質(zhì)過氧化自由基和羥基自由基是導(dǎo)致人體衰老的主要自由基[2]，保持機體合適水平的自由基清除劑和抗氧化劑能夠推遲衰老。我國提前進入老齡化社會，研究表明，自由基可以引發(fā)老年退行性疾�。ㄅ两鹕�、心腦血管病、老年癡呆癥、中風(fēng)等），天然抗氧化劑對老年退行性疾病具有預(yù)防和治療作用[3]。目前對天然抗氧化劑的研究較多，比如白藜蘆醇[4]、茶多酚[5]、銀杏葉提取物等[6]，而富含多種生物活性成分的植物精油為研究、開發(fā)天然抗氧化劑提供了充足的原料。沙漠果作為新疆的特色干果，其營養(yǎng)豐富，含油量達到67%m，含有多種生物活性物質(zhì)，其不飽和脂肪酸達到70%以上，是一種新型的保健食用油。研究沙漠果油的抗氧化活性，開發(fā)新的天然抗氧化劑，充分利用新疆資源，促進新疆特色產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。
，目的是在損失很少信息的基礎(chǔ)上簡化數(shù)據(jù)和揭示變量之間的關(guān)系[8-9]。對富含多種生物活性的沙漠果油體外抗氧化的基礎(chǔ)上，結(jié)合PCA方法預(yù)測其活性物質(zhì)單體和抗氧化之間的相關(guān)性，確定體外抗氧化的關(guān)鍵物質(zhì)。試驗在研究沙漠果油提取方法的基礎(chǔ)上，分別采用索式法、超聲波法、水酶法、水代法、回流法從新疆沙漠果中提取沙漠果油，使用GC-MS測定不同沙漠果油樣本脂肪酸和甾醇類物質(zhì)的組成。研究不同沙果油樣本的體外抗氧化能力，分別測定DPPH自由基、ABTS+自由基、超氧陰離子自由基和羥基自由基的清除能力，并通過PCA分析沙漠果油脂肪酸、甾醇與抗氧化活性的相關(guān)性。旨在為新疆沙漠果功能性產(chǎn)品開發(fā)提供理論依據(jù)，增加沙漠果的產(chǎn)品的多樣性。
1 材料與方法
1.1材料、儀器與設(shè)備
沙漠果，新疆石河子市農(nóng)貿(mào)市場。
DPPH．：上海源葉生物科技有限公司；ABTS:合肥博美生物科技有限責(zé)任公司；石油醚（分析純，沸程30℃～60℃），無水乙醇、過硫酸鉀、甲醇、tris、鄰苯三酚、鄰二氮菲、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、硫酸亞鐵、過氧化氫、乙醚、碳酸鈉、正己烷、吡啶、乙酸酐、氫氧化鈉、鹽酸，均為國產(chǎn)分析純。Neofuge 15R臺式高速冷凍離心機：力康發(fā)展有 限公司；PHS-3C雷磁pH計：上海精科；ZXRD-7080全自動新型鼓風(fēng)干燥箱：上海智城分析儀器制造有限公司；DK-8D數(shù)顯恒溫水浴鍋：金壇市醫(yī)療儀器廠；RE52-98旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；ScionSQ，456-GC氣相色譜儀：美國布魯克公司；Ultrospec5300 pro紫外可見分光光度計：上海市浦東張江高科技園區(qū)。
1.2試驗方法
1.2.1沙漠果油的制備
分別采用5種不同的提取方法制備沙漠果油。
1.2.1.1索式法
料液比1：14( g/mL)、提取溫度65℃、提取時間4h，簡稱樣1。
1.2.1.2超聲波法
功率200 W、頻率45 kHz、料液比1：14(g／mL)、溫度35℃、時間22 min，簡稱樣2。
1.2.1.3水酶法
采用堿性蛋白酶酶解，在酶解pH為8、溫度59℃、時間1.9 h、酶添加量為1 200 U/g，簡稱樣3。
1.2.1.4水代法
兌水pH為6、料液比1：10( g/mL)、浸提溫度70℃、時間2h，簡稱樣4。
1.2.1.5熱回流法
料液比1：10( g/mL)、提取溫度45℃、提取時間4h，簡稱樣5。
1.2.2沙漠果油中主要生物活性成分的測定
1.2.2.1脂肪酸的測定
脂肪酸的測定方法參見田洪磊[10] 稍做修改。
1.2.2.2 甾醇及VE等其他物質(zhì)測定
甾醇及VE等其他物質(zhì)測定方法參見田洪磊[10] 稍做修改。
1.2.3沙漠果油抗氧化性能研究
1.2.3.1 DPPH自由基清除能力[10]
配制0.1 mmol/L DPPH．的溶液，用無水乙醇將5種方法制備的沙漠果油樣品及VE對照品配制成10，15，20，25，30和40 mg/mL待測。取2 mL DPPH．待清除液，加入2 mL不同質(zhì)量濃度的待測油樣，在室溫黑暗條件下靜置30 min后取出，在517 nm處測定吸光度At，并用2 mL蒸餾水代替油樣作為空白對照Ao，用2 mL無水乙醇代替DPPH．溶液作為樣品吸光度A’蒸餾水做參比對照，平行三次。則沙漠果油對DPPH．的清除率可表示為：
DPPH．的清除率=1-（At-A’）/A0×100% (1)
1.2.3.2 ABTS+自由基清除能力[11]
稱取70.2 mg過硫酸鉀溶于100 mL甲醇，用過硫酸鉀甲醇溶液溶解ABTS+自由基，配成7.4 mmol/LABTS+．母液，在室溫及黑暗條件下，靜置過夜。
ABTS+．待測液：吸取1 mL ABTS+．母液用甲醇稀釋5倍，在744 nm波長吸光度為0.700±0.020（吸光度為0.710），把全部母液按此比例稀釋到所需的吸光度待測。
取2 mL ABTS+．測定液，加入2 mL不同濃度的油樣，在黑暗處（室溫）放置30 min取出，在744 nm波長處測定吸光度，以甲醇做參比。以VE為陽性對照。則沙漠果油對ABTS+清除率可表示為：
ABTS+．清除率=（A空白樣品-（A樣品-A對照））/A空白樣品×100% (2)
式中：A空白樣品-2 mL甲醇+2 mL ABTS+．的吸光度；A樣品-2 mL油樣+2 mL ABTS+．的吸光度；A對照 -2 mL油樣+2 mL甲醇的吸光度。
1.2.3.3超氧陰離子自由基的清除能力[12]
用無水乙醇將不同方法沙漠果油配制成1，3，5，7，10和12 mg/mL的待測液，取0.1 mL不同質(zhì)量濃度的沙漠果油于試管中，加入2.9 mL 0.05 mol/L pH 8.2的Tris-HCl，混合均勻后在25℃水浴20 min后，加入0.1 mL 3 mmol/L鄰苯三酚溶液，混合均勻后25℃水浴5 min后，加入1 mL 8 mmol/L HC1終止反應(yīng)。在299 nm波長處測定吸光度，以蒸餾水做參比。以VE做陽性對照。則沙漠果油對超氧陰離子自由基的清除率可表示為：
超氧陰離子自由基的清除率=（1-（A1-A2）/A3）×100% (3)
式中：A1-0.1 mL沙漠果油+2.9 mL Tris-HCl+0.1 mL鄰苯三酚+1 mL HC1的吸光度；A2-0.1 mL沙漠果油+2.9 mL Tris-HCl+0.1 mL無水乙醇+1 mL HC1的吸光度；A3-0.1 mL蒸餾水+2.9 mL Tris-HCl+0.1 mL鄰苯三酚+1 mL HC1的吸光度。
1.2.3.4羥基自由基清除能力[13]
用無水乙醇將不同方法沙漠果油配制成1，2，3，4，5，6 mg/mL的待測液，取1 mL質(zhì)量不同濃度的沙漠果油于試管中，加入1 mL 0.75 mmol/L鄰二氮菲和2 mL 0.2 mol/L pH 7.4的磷酸緩沖液，將混合物搖勻后加入1mL 0.75 mmol/L硫酸亞鐵溶液，搖勻后加入0.1%的過氧化氫1 mL，搖晃均勻后再37 0C水浴1h，在536 nm波長處測定吸光度。則沙漠果油對羥基自由基的清除率可表示為：
羥基自由基的清除率=（A1-A3）／（A2-A3）×100% (4)
式中：A1-1mL鄰二氮菲+2 mL PBS+1 mL油樣+1mL FeSO4+1 mL H202的吸光度；A2-1 mL鄰二氮菲+2mL PBS+1 mL油樣+1 mL FeSO4+1 mL蒸餾水的吸光度；A3-1 mL鄰二氮菲+2 mL PBS+1 mL蒸餾水+1 mLeS04+1 mL H202的吸光度。
1.2.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析
采用SPSS 18.0計算IC50值，并對活性物質(zhì)測定結(jié)果進行多重比較檢驗（p<0.05存在差異性），采用PCA分析法分析其相關(guān)性，所有數(shù)據(jù)進行3次平行。
2結(jié)果與討論
2.1不同方法制備沙漠果油主要生物活性物質(zhì)分析
由表1、表2 GC-MS測定沙漠果活性成分結(jié)果可知，幾種方法制備的沙漠果油的生物活性成分多樣且存在顯著差異(p<0.05)，其中包含脂肪酸有14種，甾醇和其他生物活性物質(zhì)10種。各個樣品的單不飽和脂肪酸含量在36.95%—41.40%之間，多不飽和脂肪酸含量在29.01%—33.96%之間，較其他四種方法水酶法制備的樣品不飽和脂肪酸含量最高。水酶法
制備的樣品中油酸、亞油酸含量最高，十五烷酸、十七烷酸、亞麻酸、二十二烷酸、二十三烷酸、蓖麻油酸和木蠟酸未檢出；超聲波法制備的樣品中油酸、亞油酸、棕櫚酸含量較高，肉豆蔻酸、十五烷酸、十七烷酸、亞麻酸、二十二烷酸、二十三烷酸、蓖麻油酸和木蠟酸未檢出；水代法制備的樣品中油酸、花生酸、蓖麻油酸含量相對較高，十五烷酸、二十二烷酸二十三烷酸和木蠟酸未檢出；回流法制備的樣品中棕櫚酸、棕櫚油酸、肉豆蔻酸含量最高，花生酸、二十三烷酸和木蠟酸未檢出；索式法制備的樣品中棕櫚酸、棕櫚油酸、十七烷酸、硬脂酸、亞麻酸和蓖麻油酸含量相對較高。與脂肪酸相比，各個樣品中甾醇和其他生物活性物質(zhì)之間也存在較明顯的差異，水酶法制備樣品中豆甾醇△6. 22、膽甾-8，24--烯-3-醇、角鯊烯含量較高，水代法制備樣品中膽甾-5-烯-3-醇、膽甾醇含量相對較高，回流法制備樣品中膽甾-5-烯-3-醇、膽甾-8-烯-3-醇、膽甾醇、3-谷甾醇含量較高，索式法制備樣品中角鯊烯和VE含量最高。
2.2沙漠果油抗氧化活性
2.2.1 DPPH自由基清除能力
由圖1可以看出，5種方法制備的沙漠果油對DPPH自由基的清除效果隨著沙漠果油濃度的增加而增大，呈很好的劑量關(guān)系，對DPPH自由基的清除效果較好。5種方法中水酶法提取的沙漠果油的清除效果最好，清除效果比VE弱。索式法、超聲波法、水酶法、水代法、回流法及VE的IC50值分別為29.68，24.71，21.74, 26.37, 25.31和10.62 mg/mL，其對DPPH自由基的清除效果為：VE>水酶法>超聲波法>回流法>水代法>索式法。
2.2.2 ABTS+自由基清除能力
從圖2可知，5種方法制備的沙漠果油樣品對ABTS+自由基有良好的清除效果，且隨著沙漠果油質(zhì)量濃度增大而增加，清除率與濃度呈正相關(guān)。濃度為16 mg/mL時水酶法提取的樣品清除率達到73.59%，VE達到99.76%，清除效果較VE稍弱。索式法、超聲波法、水酶法、水代法、回流法及VE的IC50值分別為15.20, 10.86, 8.47, 13.74, 11.89和1.53 mg/mL，其對ABTS+自由基的清除效果為：VE>水酶法>超聲波法>回流法>水代法>索式法。
2.2.3超氧陰離子自由基的清除能力
由圖3可知，在質(zhì)量濃度1～12 mg/mL的測定范圍內(nèi)，5種不同方法制備的沙漠果油對超氧陰離子自由基清除能力隨著質(zhì)量濃度的增加而增加，清除率與質(zhì)量濃度呈正相關(guān)，對超氧陰離子自由基的清除效果明顯。5個樣品清除效果均弱于VE，索式法、超聲 波法、水酶法、水代法、回流法及VE的IC50值分別為 7.17, 8.15，7.28, 7.83，6.51和1.60 mg/mL，其對超氧陰離子自由基清除能力大小為：VE>回流法>索式法>水酶法>水代法>超聲波法。
2.2.4羥基自由基清除能力
由圖4可以看出，在測定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，沙漠果油對羥基自由基有較強的清除能力，隨著質(zhì)量濃度的增加清除能力上升，清除效果與質(zhì)量濃度有很好的相關(guān)性。當(dāng)質(zhì)量濃度為6 mg/mL時，水酶法對羥基自由基清除率達到92.88%，比VE同質(zhì)量濃度的清除率(86.54%)高，有超過VE的趨勢。索式法、超聲波法、水酶法、水代法、回流法及VE的IC50值分別為3.10, 2.86，2.49, 3.43, 3.26和2.38 mg/mL，其對羥基自由基清除能力大小為：VE>水酶法>超聲波法>索式法>回流法>水代法。
2.2.5不同樣品抗氧化能力的IC50值
由表3可知，5種不同方法制備的沙漠果油樣本抗氧化能力存在顯著性差異，這可能與其生物活性物質(zhì)的種類和含量的差異有關(guān)，對于具有復(fù)雜成分的天然物質(zhì)的抗氧化體系中清除自由基可能是由多種抗氧化物質(zhì)共同作用完成的。
2.3差值系數(shù)分析
為了更明確的不同方法制備沙漠果油樣本中相關(guān)活性物質(zhì)與抗氧化能力的關(guān)系，找出不同樣本含量差異較大的成分尤為重要。差值系數(shù)可以直觀的比較不同方法制備樣品活性物質(zhì)的之間的變化程度，以傳統(tǒng)索式法制備的沙漠果油樣本為參照，計算其他4個樣品相關(guān)物質(zhì)的差值系數(shù)[14]。
Y=（Ax-A0）/A0 (5)
式中：Y-差值系數(shù)；Ax-其他4種方法的活性物質(zhì)含量；A0-索式法制備樣品同一物質(zhì)含量。
差值系數(shù)越大，代表差異越大，肉豆蔻酸（-0.67）、棕櫚油酸（-0.71）、花生酸(0.62)、豆甾醇△6.22( 1.06)、膽甾醇(1.1 1)和B--谷甾醇(0.67)差值系數(shù)大，但有些物質(zhì)含量基準(zhǔn)較大，顯示的差值系數(shù)會較小，如油酸(36.39%)、亞油酸(29.20%)、角鯊烯( 66.82%)等，差值系數(shù)與PCA結(jié)合分析，可以排除差異較小的物質(zhì)。
2.4差異顯著活性物質(zhì)與抗氧化能力的PCA分析
在對不同沙漠果油樣品抗氧化能力的研究基礎(chǔ)上，為明晰沙漠果油多種生物活性物質(zhì)體外抗氧化的作用方式，采用PCA分析5種沙漠果油樣品中的24種主要活性物質(zhì)和抗氧化指標(biāo)的相關(guān)性。采用SPSS分析軟件中PCA分析相關(guān)性結(jié)果圖5所示。
由圖5可知，第1成分貢獻率為55.29%，第2成分貢獻率為22.54%，2個成分的累計貢獻率已達到77.83%，因此這2個主成分可以說明該數(shù)據(jù)的變化趨勢，可以采用這2個成分做相關(guān)性分析。油酸、亞油酸、蓖麻油酸靠近DPPH自由基，其差值系數(shù)分別為0.13、0.16和-0.36，油酸(36.39%)和亞油酸(29.20%)基準(zhǔn)含量高，所以差值系數(shù)小，油酸、亞油酸、蓖麻油酸可能與清除DPPH自由基相關(guān)；肉豆蔻酸、棕櫚油酸、十五烷酸、十七烷酸和亞麻酸
靠近ABTS+自由基，其差值系數(shù)為-0.67、-0.71、0.00、- 0.10和-0.13，十五烷酸的基準(zhǔn)(0.01%)、
十七烷酸(0.10%)和亞麻酸(0.11%)含量低，差值系數(shù)低，所以十五烷酸、十七烷酸、亞麻酸除外，肉豆蔻酸、棕櫚油酸其協(xié)同作用對清除ABTS+自由基起關(guān)鍵作用；豆甾醇△6, 22、膽甾-8，24--烯-3-醇和麥角甾-8-烯-3-醇較接近超氧陰離子，可能是清除超氧陰離子的關(guān)鍵物質(zhì)；角鯊烯、VE和豆甾醇△5，22接近羥基自由基，其差值系數(shù)分別為-0.11、-0.28和0.20,角鯊烯(66.82%)基準(zhǔn)含量較高，所以差值系數(shù)小，豆甾醇△5，22( 1.14%)和VE( 0.39%)基準(zhǔn)含量低，差
值系數(shù)也低，所以忽略豆甾醇△5，22和VE，角鯊烯可能與清除羥基自由基有緊密的相關(guān)性。
3結(jié)論
GC-MS共檢測出24種具有明顯差異性的活性物質(zhì)，其中包括14種脂肪酸，10種甾醇和其它生物活性物質(zhì)。沙漠果油有很好的抗氧化的能力，5種不同樣本對不同的自由基清除效果也不同，通過比較IC50值，對DPPH自由基的清除效果為：VE>水酶法>超聲波法>回流法>水代法>索式法，對ABTS+自由基的清除效果為：VE>水酶法>超聲波法>回流法>水代法>索式法，對超氧陰離子自由基清除能力大小為：VE>回流法>索式法>水酶法>水代法>超聲波法，對羥基自由基清除能力大小為：VE>水酶法>超聲波法>索式法>回流法>水代法。通過PCA
分析沙漠果油生物活性物質(zhì)和抗氧化指標(biāo)之間的相關(guān)性，油酸、亞油酸、蓖麻油酸可能與清除DPPH自由基相關(guān)，肉豆蔻酸、棕櫚油酸靠近ABTS+自由基且差值系數(shù)大，其協(xié)同作用對清除ABTS+自由基起關(guān)鍵作用，豆甾醇△6，22、膽甾-8，24--烯-3-醇和麥角甾-8-烯-3-醇較接近超氧陰離子，可能是清除超氧陰離子的關(guān)鍵物質(zhì)，角鯊烯可能與清除羥基自由基有緊密的相關(guān)性。
沙漠果是良好的具有抗氧化作用的保健食用油，長時間食用可以預(yù)防和治療老年退行性疾病。
4摘要
分別采用索式法、超聲波法、水酶法、水代法、回流法制備新疆沙漠果油，使用GC-MS對不同提取方法制備的沙漠果油樣本中脂肪酸和甾醇等生物活性物質(zhì)的組成及含量進行分析鑒定，并以DPPH自由基、ABTS+自由基、超氧陰離子自由基和羥基自由基的清除能力為指標(biāo)，分別對樣本抗氧化能力進行測定。結(jié)果表明，沙漠果油有很好的抗氧化的能力，通過比較其IC50值，水酶法對自由基的清除作用較明顯；同時將檢測的生物活性物質(zhì)和抗氧化能力進行PCA分析與差值系數(shù)分析，初步確定清除自由基的關(guān)鍵活性物質(zhì)。
