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    雖然國(guó)內(nèi)外已經(jīng)報(bào)道各種米糠穩(wěn)定化方法，例如采用擠壓法加熱法、化學(xué)法、微波法等促使米糠中的脂肪酶和脂肪酸氧化酶失活，但這些方法不僅有設(shè)備和操作成本，也通常也導(dǎo)致米糠中天然營(yíng)養(yǎng)成分及活性物質(zhì)被破壞而失去其價(jià)值。相對(duì)而言，米糠的酶穩(wěn)定化方法由于條件溫和并能夠最大限度保持其天然成分而值得深入探討研究。酶法的原理就是利用蛋白酶使米糠中脂肪酶失活而阻止米糠油脂分解酸敗。國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道過(guò)應(yīng)用木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶及真菌蛋白酶穩(wěn)定米糠。但關(guān)于蛋白酶對(duì)米糠穩(wěn)定化的系統(tǒng)研究還鮮見(jiàn)報(bào)道，因此研究了應(yīng)用各種蛋白酶穩(wěn)定化米糠，以期篩選出價(jià)廉易得的蛋白酶及其適宜的工藝條件，為工業(yè)化酶法穩(wěn)定新鮮米糠提供科學(xué)參考。

1  材料與方法

1.1儀器與設(shè)備

    萬(wàn)能粉碎機(jī)：北京中興偉業(yè)儀器有限公司；紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；DHG一9075A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥機(jī)：上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；脂肪測(cè)定儀、凱氏定氮儀：上海嘉定糧油儀器有限公司；TG16G離心機(jī)：湖南凱達(dá)科學(xué)儀器廠；馬弗爐：沈陽(yáng)市節(jié)能電爐廠；電子天平：奧豪斯儀器（上海）有限公司。

112試驗(yàn)材料與試劑

    新鮮米糠：四川省瑞玉米業(yè)有限責(zé)任公司；堿性蛋白酶（2.4 AU—A／g）、風(fēng)味蛋白酶(500 LAPU／g)：諾維信生物技術(shù)有限公司；木瓜蛋白酶（50萬(wàn)單位儋）、菠蘿蛋白酶（80萬(wàn)單位／g）：北京奧博星生物技術(shù)有限公司；，無(wú)花果蛋白酶（80萬(wàn)單位／g）、胰蛋白酶（350萬(wàn)單位／g）：西亞試劑；中性蛋白酶（20萬(wàn)單位／g）、脂肪酶（20萬(wàn)單位／g）：江蘇銳陽(yáng)生物科技有限公司；石油醚（沸點(diǎn)30℃~60℃）、磷酸氫二鈉、鹽酸、無(wú)水乙醇、曲拉通、異丙醇、氫氧化鉀、酚酞、對(duì)硝基苯酚月桂酸，均為分析純：成都科龍化學(xué)試劑廠；蒸餾水。

1.3試驗(yàn)方法

    酶法穩(wěn)定米糠的原理是向新鮮米糠中加入蛋白酶，與水混合并在一定溫度下作用一定時(shí)間以使脂肪酶失活，再烘干至一定水分含量，從而降低或滅活脂肪酶活力，達(dá)到保鮮米糠的目的。選用堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、中性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、無(wú)花果蛋白酶和胰蛋白酶對(duì)米糠穩(wěn)定化研究。

1.3.1脂肪酶活力的測(cè)定方法

1.3.1.1測(cè)定原理

    對(duì)硝基苯酚月桂酸在脂解酶的作用下水解生成對(duì)硝基苯酚和月桂酸，對(duì)硝基苯酚在乳化層中呈黃色，在410 nm處有吸收，吸光度越大，脂肪酶活力也越大。

1.3.1.2測(cè)定方法

    將待測(cè)樣品1 mL加入3 mL含0.5%曲拉通的0.1 mol/L磷酸緩沖液( pH 7.4)中，再加入0.4 mL對(duì)硝基苯酚月桂酸的異丙醇溶液( 1.67 mg/mL)，將上述溶液置于37℃水浴加熱4h，使其充分反應(yīng)，煮沸5 min終止反應(yīng)，6 000 r/min離心8 min，取上清液于410 nm處測(cè)定吸光度，以吸光度為指標(biāo)比較脂肪酶活力，空白組為蒸餾水替代待測(cè)樣品，其它不變。

1.3.2酸價(jià)的測(cè)定方法

    將儲(chǔ)藏的米糠樣品，每隔l周取出，按GB/T 5530-2005”植物油脂檢驗(yàn)酸值測(cè)定法”的標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行測(cè)定。

1.3.3其它指標(biāo)的測(cè)定方法

    總蛋白測(cè)定參照CB 5009.5-2010，采用凱氏定氮法測(cè)定，氮換算蛋白質(zhì)系數(shù)為6.25，水分測(cè)定參照GB/T 64353-2006法測(cè)定，總脂肪測(cè)定參照GB 5009.6-2003，采用索氏提取法，灰分測(cè)定參照GB/T 6438-2007法測(cè)定。

2結(jié)果與討論

2.1米糠成分分析

通過(guò)分析檢測(cè)，新鮮米糠主要成分見(jiàn)表1。

2.2考察蛋白酶對(duì)脂肪酶活力的影響

    為篩選合適的蛋白酶，以商品脂肪酶為研究對(duì)象，考察各種蛋白酶對(duì)脂肪酶的滅活作用，商品脂肪酶和米糠脂肪酶對(duì)脂肪的水解機(jī)理是相同的，以此來(lái)篩選合適的蛋白酶，可大大縮短試驗(yàn)周期，試驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

    準(zhǔn)確量取脂肪酶液( 80 U/mL) 0.5 mL，加入各種蛋白酶液（5 000單位或0.012 AU-A、2.5 LAPU）0.5 mL，在50℃反應(yīng)4h，再降溫至37℃，按照方法1.3.1測(cè)定殘余脂肪酶活力，對(duì)照組為脂肪酶液(80 UlmL) 0.5 mL加0.5 mL蒸餾水，其它不變。

    由試驗(yàn)結(jié)果可知，第8為對(duì)照組，第1~第7為蛋白酶添加組，添加蛋白酶組吸光度越低，表示對(duì)脂肪酶滅活作用越強(qiáng)。堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶和菠蘿蛋白酶對(duì)脂肪酶有一定的滅活作用，其中堿性蛋白酶吸光度最低，表示對(duì)脂肪酶滅活作用最強(qiáng)，其它蛋白酶對(duì)脂肪酶作用非常弱。因堿性蛋白酶對(duì)脂肪酶作用最為敏感，故選取堿性蛋白酶考察最佳的滅活條件。

2.2.1考察堿性蛋白酶作用時(shí)間對(duì)脂肪酶活力的影響

  準(zhǔn)確量取脂肪酶液( 80 U/mL) 0.5 mL，加入堿性蛋白酶液( 0.012 AU-A/mL) 0.2 mL，再加入0.3 mL蒸餾水補(bǔ)至1  mL，分別在50℃反應(yīng)0.5，l，2，3，4和Sh，再降溫至37℃，按方法1.3.1測(cè)定殘余脂肪酶活力，對(duì)照組為脂肪酶液( 80 U/mL) 0.5 mL加0.5 mL蒸餾水，其它不變。

    由試驗(yàn)結(jié)果可知，隨做作用時(shí)間的延長(zhǎng)，堿性蛋白酶對(duì)脂肪酶的滅活作用越強(qiáng)，當(dāng)作用4h，幾乎可將脂肪酶完全滅活。

2.2.2考察堿性蛋白酶用量對(duì)脂肪酶活力的影響

    準(zhǔn)確量取脂肪酶液( 80 U/mL) 0.5 mL，堿性蛋白酶( 0.012 AU-A/mL)液量分別為0.05，0.1，0.2，0.3，0.4和0.5 mL，加蒸餾水補(bǔ)至1 mL，溫度50℃，時(shí)反應(yīng)間4h后，再降溫至37℃，按方法1.3.1測(cè)定殘余脂肪酶活力。

  由此可見(jiàn)，隨著堿性蛋白酶用量的增大，吸光度越低，表明堿性蛋白酶對(duì)脂肪酶的滅活增強(qiáng)，當(dāng)添力[量為0.5 mL時(shí)抑制達(dá)到最大。

2.3不同作用方式對(duì)米糠的穩(wěn)定化研究

2.3.1蛋白酶直接與米糠混合后作用一定時(shí)間

    稱取300.0 9新鮮米糠（粉碎過(guò)篩100目）與iso萬(wàn)單位蛋白酶或7.2 AU-A混合均勻后，在50℃干燥箱中放置4 h，空白組不加蛋白酶，用自封袋密封，在室溫下保存。每隔1周索氏提取油脂測(cè)定酸值，共計(jì)8周。

    由試驗(yàn)結(jié)果可知，隨著儲(chǔ)藏時(shí)間的延長(zhǎng)，空白組米糠油酸值增加非常迅速，前3周增加速度最快，第3周酸值高達(dá)127.1 mg，之后酸值增加趨于平緩，對(duì)第1，第2和第3周的酸值進(jìn)行線性擬合得標(biāo)準(zhǔn)曲線y=25.850x+48.433（R2=0.994 4），斜率25.850即為每周酸值平均增加25.850 mg。堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶和菠蘿蛋白酶酸值增加相對(duì)比較平緩，對(duì)8周的酸值進(jìn)行擬合得堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶和菠蘿蛋白酶標(biāo)準(zhǔn)曲線分別i:Jy=11.957x+30.418（R2=0.9831），y=12.33lx+32.361(R2=0.983 1),y=12.305 x+30.954（R2=0.991）。酸值增加速率分別為11.957，12.331和12.305 mg/周，增加速率分別為空白組的0.46倍，0.48倍和0.48倍，空白組存儲(chǔ)8周后酸值為154.0 mg，酸值增加了137.3 mg。堿性蛋白酶組的酸值為126.7 mg，酸值增加了110.0 mg，為空白組的80.1%，木瓜蛋白酶組的酸值為129.9 mg，酸值增加了113.2 mg，為空白組的82.4%，菠蘿蛋白酶組的酸值為132.7 mg，酸值增加了116.0 mg，為空白組的84.5%。結(jié)果表明，堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶和菠蘿蛋白酶對(duì)米糠穩(wěn)定化有一定作用，但這種方式作用并不明顯。

2.3.2蛋白酶溶液與米糠混合后作用一定時(shí)間

    用蒸餾水配制1 50萬(wàn)單位或7.2 AU-A蛋白酶水溶液150 mL，稱取300.0 9新鮮米糠（粉碎過(guò)篩100目），將堿性蛋白酶溶液加入米糠中攪拌混合均勻后，在50 cC干燥箱中放置烘干至水分小于8%，用自封袋密封，在室溫下保存。每隔1周索氏提取油脂測(cè)定酸值，共計(jì)8周。

    由試驗(yàn)結(jié)果可知，蛋白酶液組的酸值增加相對(duì)直接混合更加緩慢，對(duì)8周的酸值進(jìn)行擬合得堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶和菠蘿蛋白酶標(biāo)準(zhǔn)曲線分別為y=2.839 3x+41.911(R2=0.866 9),y=3.540 Sx+49.168(R2=0.991 8),y=3.740 5x+47.243( R2=0.984 2).酸值增加速率分別為2.839 3，3.540 5和3.740 5 mg/周，增加速率分別為空白組的0.11倍，0.14倍和0.14倍，存儲(chǔ)8周后堿性蛋白酶組的酸值為67.9 mg，酸值增加了51.2 mg，為空白組的37.3%，木瓜蛋白酶組的酸值為76.3 mg，酸值增加了59.6 mg，為空白組的43.4%，菠蘿蛋白酶組的酸值為77.5 mg，酸值增加了60.8 mg，為空白組的44.3%。

    結(jié)果表明蛋白酶溶液與米糠混合處理的結(jié)果優(yōu)于蛋白酶直接與米糠混合的結(jié)果，與木瓜蛋白酶和菠蘿蛋白酶相比，堿性蛋白酶對(duì)米糠穩(wěn)定的效果更佳。

3結(jié)論

米糠穩(wěn)定化處理是有效利用米糠的必要前提。脂肪酶是一種蛋白質(zhì)，蛋白酶通過(guò)水解作用將脂肪酶水解為肽，從而使脂肪酶喪失將脂肪水解為脂肪酸和甘油三酯的能力。同空白組相比，蛋白酶對(duì)米糠穩(wěn)定化有一定作用，蛋白酶直接與米糠混合的效果不及蛋白酶溶液與米糠混合的效果，其中，經(jīng)堿性蛋白酶溶液處理后的新鮮米糠在室溫下儲(chǔ)藏效果最佳，存儲(chǔ)2個(gè)月后，增加的酸值僅為空白組的37.3%。表明蛋白酶對(duì)米糠穩(wěn)定化有一定作用。

4摘  要 

 采用酶法穩(wěn)定米糠，先以商品源脂肪酶為模擬研究對(duì)象，試驗(yàn)堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、中性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、無(wú)花果蛋白酶和胰蛋白酶對(duì)脂肪酶的滅活作用，得到堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶對(duì)脂肪酶有較強(qiáng)的滅活作用；并據(jù)此研究了蛋白酶對(duì)新鮮米糠的穩(wěn)定化作用。結(jié)果是經(jīng)堿性蛋白酶溶液處理后的新鮮米糠在室溫下儲(chǔ)藏效果最佳，增加的酸值僅為空白組的37.3%。