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作者：張毅

  近年來(lái)，隨著酶的理論與實(shí)際應(yīng)用的發(fā)展，酶法分析已成為分析化學(xué)的一個(gè)重要分支，辣根過(guò)氧化物酶( HRP)是從植物中提取的一種重要的酶制劑，被廣泛應(yīng)用于生物工藝技術(shù)、生物傳感器及有機(jī)合成等領(lǐng)域。介質(zhì)環(huán)境對(duì)HRP催化熒光反應(yīng)體系的影響已有報(bào)道，HRP在NH。．H：O-NH。Cl堿性緩沖環(huán)境(pH 9.5)下不變性而表現(xiàn)出高的活性，是由于氮配體NH。的存在拓寬了HRP的活性pH范圍。L-酪氨酸(L-Tyr)在HRP催化下可被H2 02氧化為二聚體的強(qiáng)熒光物質(zhì)，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)痕量硒對(duì)該熒光體系具有較強(qiáng)的猝滅作用，據(jù)此建立了測(cè)定痕量硒的酶催化熒光猝滅法。

1  實(shí)驗(yàn)部分

1.1  儀器和主要試劑

    FP-6500型熒光光譜儀（日本Jasco公司）；pHS-3C型酸度計(jì)（上海理達(dá)儀器廠）；電子分析天平（北京賽多利斯天平有限公司）。

    硒(Iv)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液：1 000 ptg／mL，稱取0.109 5 g優(yōu)級(jí)純Na：Se0。（上海第一試劑廠）溶于100 mL水中配制而成；硒㈣標(biāo)準(zhǔn)溶液：100ug/mL，使用時(shí)用硒㈣標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液逐級(jí)稀釋而成；HRP溶液：5.00×10-6mol／L，由HRP（酶活性為250～330 U／mg，酶純度Rz一3．O）配制而成；0Tyr溶液：5.00×10 4 mol／L; H202（）：10. 60 mol／L，由高錳酸鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液標(biāo)定；H202：1.00×10-3 mol／L，由H。q配制而成，棕色瓶裝，現(xiàn)用隨配；NH3．H20-NH4Cl緩沖溶液(pH10.0)：由0.1mol／L NH4 Cl溶液和0.1 mol／L NH3．H20溶液在pH計(jì)下混合配制而成。

    所有試劑均為分析純；實(shí)驗(yàn)用水為二次石英亞沸水。

1.2  實(shí)驗(yàn)方法

    取兩支刻度一致的10 mL具塞比色管，向其中一支加入0. 40 mL 100 ug/mL硒㈣標(biāo)準(zhǔn)溶液，另一支不加（試劑空白），依次加入2.00 mL pH 10.0的NH3．H20NH4Cl緩沖溶液、1.50 mL L-Tyr溶液、1. 00 mL HRP溶液、1.00 mL 1.00×10 3 mol／L H202,用水定容。在室溫下反應(yīng)20 min，在選定的激發(fā)波長(zhǎng)314 nm和發(fā)射波長(zhǎng)404 nm下，測(cè)定其熒光強(qiáng)度，計(jì)算熒光猝滅值A(chǔ)F= Fc, -F，。其中：F。為試劑空白即不加硒㈣標(biāo)準(zhǔn)溶液體系的熒光強(qiáng)度，F(xiàn)i為加硒㈣標(biāo)準(zhǔn)溶液體系的熒光強(qiáng)度。

2  結(jié)果與討論

2.1  熒光光譜

按圖1所示的系列溶液和實(shí)驗(yàn)方法操作，在熒光光譜儀上掃描并繪制熒光光譜。由圖1中曲線0與0 7可看出，在HRP的催化作用下，H2 02能夠氧化/_-Tyr反應(yīng)產(chǎn)生熒光，反應(yīng)產(chǎn)物的最大激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)分別為。由圖1中曲線1和1’、2’和2 7、3和3 7對(duì)比可知，當(dāng)體系中加入不同濃度的硒㈣標(biāo)準(zhǔn)溶液時(shí)，體系的熒光強(qiáng)度顯著降低，表明硒㈣對(duì)H202氧化L-Tyr的熒光體系具有明顯的猝滅作用。進(jìn)一步研究表明，體系A(chǔ)F和硒㈣的質(zhì)量濃度呈線性關(guān)系。

2.2  測(cè)定條件的優(yōu)化

2. 2.1  緩沖體系和酸度

    酸度對(duì)酶促反應(yīng)的影響是多方面的，如強(qiáng)酸或強(qiáng)堿介質(zhì)都可以使酶的空間構(gòu)象發(fā)生改變，使酶失活；另外，酸度可改變底物的解離狀態(tài)，影響它與酶的結(jié)合。因而，酸度是酶（或模擬酶）促反應(yīng)需要用緩沖溶液嚴(yán)格控制的條件之一。為此，試驗(yàn)比較了NH3 -NH4Cl、Tris - HC1、Naz C03 -NaHC()3、Na2 HP04-NaH2 P04、甘氨酸NaOH、硼砂-NaOH等緩沖體系對(duì)熒光反應(yīng)的影響。結(jié)果表明：HRP催化H2 02氧化L—Tyr的熒光反應(yīng)體系在堿性環(huán)境中熒光量子產(chǎn)率比在酸性環(huán)境中要高；對(duì)于堿性環(huán)境來(lái)說(shuō)，體系在NH3一NH4Cl緩沖體系中的熒光強(qiáng)度又比在Na2 CO3NaHC03緩沖體系中強(qiáng)，這可能是因?yàn)镠RP的催化反應(yīng)可被NH3配體所增強(qiáng)。在pH 9～11范圍內(nèi)進(jìn)行試驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在選定的N H:a -NH。Cl緩沖體系中，隨著pH的增大，硒㈣對(duì)熒光體系的猝滅作用先增大后減少，且在pH 10.0時(shí)AF值最大。因此，反應(yīng)介質(zhì)選擇pH 10.0的NH3-NH4Cl緩沖溶液。進(jìn)一步試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)pH 10.0的NH3-NH4Cl緩沖溶液加入量為1.5～3.5 mL時(shí)，AF值最大且穩(wěn)定。實(shí)驗(yàn)選用2.0 mL pH 10.0的NH3-NH4Cl緩沖溶液。

2.2.2   L-Tyr溶液用量

    改變5. 00×10'4 mol／LI-- Tyr溶液的用量(0. 50～2.50 mL)進(jìn)行試驗(yàn)。結(jié)果表明：當(dāng)L-Tyr

的濃度增大時(shí)，硒㈣對(duì)體系的熒光猝滅程度先增強(qiáng)后減弱；當(dāng)L_ Tyr溶液濃度為7.50×lO-5 mol／L時(shí)AF最大。因此實(shí)驗(yàn)選用1.50 mL /_-Tyr溶液為最佳用量，此時(shí)體系中L—Tyr的質(zhì)量濃度為7.50×10-5 mol／L。

2.2.3     Hz Oz用量

    H2 02在反應(yīng)體系中作為氫受體底物，它的濃度直接影響到反應(yīng)的速度和完全程度。當(dāng)H2 02的濃度過(guò)低時(shí)，其氧化L- Tyr的反應(yīng)不能完全。按實(shí)驗(yàn)方法，改變H2 02的用量進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果表明，當(dāng)1.00×10-3 mol／L H2 02用量為0.9～1.2 mL時(shí)，AF最大且穩(wěn)定。實(shí)驗(yàn)選用1.00 mL 1.00×101 mol／L H2 02溶液，此時(shí)體系中H202濃度為1.00×10 4 mol／L。

2.2.4    HRP溶液用量

    當(dāng)HRP濃度很低時(shí)，在測(cè)定時(shí)間內(nèi)催化反應(yīng)不完全。試驗(yàn)表明，當(dāng)HRP濃度在2.0×10-7～6．0×10。7mol／L時(shí)，體系A(chǔ)F最大且穩(wěn)定。實(shí)驗(yàn)選擇1.00 mL 5.00×10-6 mol／L HRP溶液，此時(shí)體系中HRP濃度為5.00×l0-7mol／L。

2.2.5  反應(yīng)時(shí)間

    在實(shí)驗(yàn)選定的條件下，反應(yīng)20 min時(shí)AF值達(dá)到最大且穩(wěn)定，并在50 min內(nèi)保持恒定。故實(shí)驗(yàn)選擇反應(yīng)20 min后測(cè)定。

2.3  校準(zhǔn)曲線和檢出限

    在上述確定的實(shí)驗(yàn)條件下，按照實(shí)驗(yàn)方法加入不同體積的硒㈤標(biāo)準(zhǔn)溶液，測(cè)定并繪制校準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，硒㈣的質(zhì)量濃度在0.1～10.0ug/mL范圍內(nèi)與AF呈線性關(guān)系。用最小二乘法回歸處理，得到校準(zhǔn)曲線的線性回歸方程為AF =83. 123 ps。㈣（ug/mL）+0. 068 5，相關(guān)系數(shù)r=0. 999 5。按實(shí)驗(yàn)方法對(duì)4.0ug/mL硒㈣試液進(jìn)行11次測(cè)定，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.9%。在同樣條件下對(duì)空白溶液連續(xù)測(cè)定11次，以其3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差計(jì)算方法中硒檢出限為0. 03 ug/mL。

3  樣品分析

    取富硒土壤樣品，于室內(nèi)自然風(fēng)干，剔去大根系及雜物，四分法縮分樣品，用木錘研碎后過(guò)2 mm尼龍篩，研磨過(guò)100目(0. 147 mm)篩。稱取晾干研磨過(guò)的50.0 g（精確到0.000 1 g）土壤樣品于150mL三角消化瓶中，加入40 mL硝酸一高氯酸(V(HN03)：V(HCl04)=3：2）混合酸，蓋上小漏斗，放置過(guò)夜。次日于160℃自動(dòng)控溫消化爐上，消化至棕黃色煙霧消失土壤顏色發(fā)白（如消化不完全，補(bǔ)加適量硝酸一高氯酸混合酸再消化）。繼續(xù)消化至冒盡白煙后，繼續(xù)加熱，2 min內(nèi)取下，稍冷后向消化瓶中加入10 mL 6.0 mol／L鹽酸，置于沸水浴中加熱至溶液大約剩余5.0mL，取下消化瓶，稍冷，將消化液趁熱過(guò)濾于10 mL容量瓶中，冷卻，定容，搖勻，待測(cè)。移取適量待測(cè)液，按實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行測(cè)定，并采用AAS進(jìn)行比對(duì)試驗(yàn)，同時(shí)進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可見(jiàn)：測(cè)定值與AAS基本一致，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD，n=6）為1.6%～3.2%，回收率在98%～103%范圍內(nèi)。

4摘要：在氨性緩沖介質(zhì)中，痕量硒㈣能阻抑辣根過(guò)氧化物酶( HRP)催化H202。氧化L，酪氨酸(L Tyr)產(chǎn)生熒光的反應(yīng)。對(duì)該體系的熒光猝滅效應(yīng)進(jìn)行了探討，并應(yīng)用于土壤中痕量硒的測(cè)定。在pH 10.0的NH3、H20-NH。Cl緩沖溶液中，控制L- Tyr、H202。和HRP的濃度分別為7. 50×10-5mol／L、1.00×10-4mol／L和5.00×10-7mol／L，在室溫下反應(yīng)20 min后，于激發(fā)波長(zhǎng)為314 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為404 nm處測(cè)定體系的熒光強(qiáng)度猝滅值(AF)。結(jié)果表明，硒㈣在質(zhì)量濃度為0. 1～10.0ug/mL范圍內(nèi)與AF呈線性關(guān)系，線性回歸方程為（ug/mL）+0.068 5，相關(guān)系數(shù)r一0.999 5。方法中硒㈣檢出限為0.03ug/mL。將體系應(yīng)用于測(cè)定富硒土壤樣品中痕量硒㈣，測(cè)定值與原子吸收光譜法(AAS)相符，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD，”一6）為1.6%一3.2%，加標(biāo)回收率為98%～103%。