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作者：鄭曉敏

   在傳統(tǒng)生產(chǎn)工藝中，主要利用化學(xué)方法以洛伐他汀為原料合成得到辛伐他汀，但近年來逐步轉(zhuǎn)向能耗低、毒性低的酶法生產(chǎn)。專利W02005/040107報(bào)告了使用酯酶作為酯化劑合成辛伐他汀，但是由于區(qū)域選擇性酯化的要求使得必須進(jìn)行其他醇基的保護(hù)，導(dǎo)致總產(chǎn)量的降低。因此，找到能夠選擇性酰化莫那可林酸的特效酶制劑，對(duì)于有效合成辛伐他汀將起到至關(guān)重要的作用。

    土曲霉的洛伐他汀生物合成基因簇編碼的一個(gè)相對(duì)分子質(zhì)量約46 000的蛋白即洛伐他汀�；�轉(zhuǎn)移酶(lovastatinacy transferase，LovD)，可將�；�硫酯的�；�基團(tuán)區(qū)域選擇性�；�化莫那可林酸C8羥基，為生物合成辛伐他汀提供有效的酶制劑。后來將LovD基因構(gòu)建到大腸桿菌中，其工程菌應(yīng)用到從莫那可林酸到辛伐他汀的合成過程中。后續(xù)高雪研究了以大腸桿菌為宿主的LovD的86、12、190、275、26、161等位點(diǎn)的定點(diǎn)突變，其突變體有效改進(jìn)了LovD的活性、溫度穩(wěn)定性及可溶性181。

    本實(shí)驗(yàn)室從LovD的原始序列出發(fā)，根據(jù)三維構(gòu)像推測影響酶活的關(guān)鍵性位點(diǎn)，進(jìn)行定點(diǎn)突變，獲得比原始序列酶活高出數(shù)倍的突變大腸桿菌菌株，但大腸桿菌工程菌容易受環(huán)境影響。目前LovD的研究主要在大腸桿菌里進(jìn)行表達(dá)發(fā)酵，國內(nèi)外尚無將此基因在畢赤酵母中表達(dá)的研究報(bào)道。巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)作為一種真核表達(dá)系統(tǒng)，具有培養(yǎng)條件簡單、易于操作、適應(yīng)性強(qiáng)、便于高密度發(fā)酵培養(yǎng)和工業(yè)化生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)。已有多種蛋白在巴斯德畢赤酵母系統(tǒng)中得以高效表達(dá)。我們從經(jīng)過多次突變優(yōu)化的LovD基因出發(fā)，將其分別構(gòu)建到胞外表達(dá)載體pPIC9K和胞內(nèi)表達(dá)載體pA0815中，篩選出合適的表達(dá)載體，實(shí)現(xiàn)了基因在宿主菌中的功能性表達(dá)，獲得了高效表達(dá)的基因工程菌，并初步進(jìn)行了SL自動(dòng)發(fā)酵罐放大試驗(yàn)，以期為LovD的大規(guī)模生產(chǎn)奠定技術(shù)基礎(chǔ)。

l  材料和方法

1.1材料

    巴斯德畢赤酵母GS115，質(zhì)粒pPIC9K、pA0815購自Invitrogen公司；含有突變的LovD基因的質(zhì)粒pET-2ld-/ovD為本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存。

    酵母提取物和蛋白胨購白OXOID公司；其他化學(xué)試劑均購自上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；rTaq DNA酶、Probest高保真聚合酶、dNTP混合物、T4DNA連接酶均購自TaKaRa公司；限制性內(nèi)切酶EcoR I、Not I、SaI I均購白NEB公司；溶壁酶(lyti-case)購自Sigma公司；質(zhì)粒小提試劑盒和瓊脂糖回收試劑盒購自北京天根有限公司；引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成；LB、YPD、BMGY、MD等培養(yǎng)基配方參考《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》（第3版）。

    ZSOI- 0057電泳儀、Gene PulserⅡ電穿孔儀（Bio-RAD公司）；瓊脂糖電泳儀（北京六一儀器廠）；SL攪拌式發(fā)酵罐（上海保興生物設(shè)備T程有限公司）；LT低溫連接儀（珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司）。

1.2    LovD基因的畢赤酵母重組質(zhì)粒構(gòu)建

    根據(jù)突變的LovD基因序列及畢赤酵母載體的多克隆位點(diǎn)分別設(shè)計(jì)2組引物，即引物L(fēng)1（5’-CCTGAATTCATGGGTTCTAACATTCJACGCAG-3’，下劃線堿基為EcoR I識(shí)別位點(diǎn)），L2（5--CCTGCGGCCGCTTAGCCCTCTTGCTATTGTGCA-3’，下劃線堿基為Not I識(shí)別位點(diǎn)）、L3（5’-CCTCAATTCATGGGTTCTAACATTGACGCAG-3’，下劃線堿基為EcoR I識(shí)別位點(diǎn)）、L4(5’- CCTGAATTCTTACCCCTGTTGCTATTGTGCA-3’，下劃線堿基為EcoR I識(shí)別位點(diǎn))，以pET-2ld-LovD（本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建保存）為模板，擴(kuò)增LovD基因，用回收試劑盒回收該P(yáng)CR產(chǎn)物片段，將回收的PCR產(chǎn)物與表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K和pA0815分別用NotI lEcoR I雙酶切和EcoR I單酶切，用T。DNA連接酶將表達(dá)載體與酶切產(chǎn)物連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌TOP10，然后在含氨芐西林(50μg/mL)的LB平板培養(yǎng)基上篩選陽性克隆，利用相應(yīng)引物進(jìn)行菌落PCR及酶切重組質(zhì)粒驗(yàn)證，將正確的菌株送上海英駿生物技術(shù)公司測序，測序結(jié)果正確，即得到重組表達(dá)載體pPIC9K-/ovD和pA0815-LovD。

1.3    LovD的畢赤酵母轉(zhuǎn)化及鑒定

    將畢赤酵母GS115單菌落挑入YPD培養(yǎng)基中活化后，按0.5%的接種量接入50 mL YPD培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，離心獲得的菌體用20 mL無菌水洗2次，再用20 mL無菌l mol/L山梨醇洗1次，加入1mL山梨醇重懸菌體獲得GS115感受態(tài)細(xì)胞。

    將大腸桿菌TOPIO（pPIC9K- LovD）和TOPIO（pA0815-LovD）置于LB液體培養(yǎng)基中，37C、200 rlmin振蕩培養(yǎng)過夜，提取重組質(zhì)粒，用SZ I內(nèi)切酶線性化重組質(zhì)粒。

    將線性化pPIC9K-LovD和pA0815-LovD的重組質(zhì)粒加入80μL (;S115感受態(tài)細(xì)胞中冰浴5min，1500 V電擊5 ms轉(zhuǎn)化，加入800μL由梨醇將細(xì)胞洗至EP管中，28C溫育2h，離心，涂MD平板培養(yǎng)至長出菌落后，劃線分離出單菌落。

    將單菌落挑人無菌水中，加入適量溶壁酶，37℃溫育1h消化細(xì)胞壁，取部分消化產(chǎn)物為模板、片段引物為鑒定引物進(jìn)行PCR，檢測陽性克隆。

1.4重組畢赤酵母菌的搖瓶誘導(dǎo)表達(dá)

    分別挑選8株陽性重組菌接人2 mL YPD液體培養(yǎng)基活化2d，以1%的接種量轉(zhuǎn)接30mL BMGY( pH8.0)液體培養(yǎng)基中，200 r/min、280C過夜培養(yǎng)，每隔24 h補(bǔ)加1%甲醇進(jìn)行誘導(dǎo)，共誘導(dǎo)72 h，收集菌液，用于酶活測定。

1.5酵母表達(dá)的LovD粗酶液的制備

1.5.1  pPIC9k- LovD胞外表達(dá)重組茵粗酶液制備取2 ml。發(fā)酵菌液，12 000 r/min離心10 min，收集上清用于酶活測定。

1.5.2  pA0815-LovD胞內(nèi)表達(dá)重組菌粗酶液的制備  取2 mL發(fā)酵菌液，離心收集菌體，用lmL0.05 mol/L磷酸鈉緩沖液(pH8.5)重懸，加入適量酸洗玻璃珠振蕩破碎20 min，離心上清作為粗酶液。

1.6  LovD酶活測定

    反應(yīng)體系參考文獻(xiàn)并改進(jìn)�？偡磻�(yīng)體積為5mL，內(nèi)含4 mg/mL莫那可林酸、0.008%   DMB- S-MMP及2 mL菌液所得上清，以pH8.5的400 mmol/L三乙醇胺緩沖溶液補(bǔ)足。在25℃、磁力攪拌條件下反應(yīng)30 min，然后取100μL，加入900μL磷酸二氫鉀一乙腈溶液，進(jìn)行高效液相色譜(HPIC)檢測。

    色譜柱為菲羅門公司的C18柱(4.6  mmx 33mm，3 μm)，流動(dòng)相為0.1%醋酸水溶液：乙腈(40:60)，等度洗脫，流速1.0 mL/min，檢測波長238 nm，柱溫25℃，進(jìn)樣量10μL。以辛伐他汀銨鹽(97.6%)為標(biāo)準(zhǔn)品，以單點(diǎn)校正方法計(jì)算反應(yīng)后辛伐他汀的含量酶活定義：在25℃、pH8.5條件下，每分鐘催化生成1mol辛伐他汀所需酶量為1個(gè)單位(U)。

1.7重組畢赤酵母菌的發(fā)酵罐放大實(shí)驗(yàn)及酶功效實(shí)驗(yàn)

    以篩選到的高酶活胞外表達(dá)重組子為出發(fā)菌株，接種到150 mL YPD液體培養(yǎng)基中，280C過夜培養(yǎng)，制成種子液，以5%的接種量接入3 L BMGY液體培養(yǎng)基（SL發(fā)酵罐）中，發(fā)酵過程中流加28%氨水控制pH值，以甘油為碳源。菌體生長階段溫度設(shè)定為28℃，pH設(shè)定為5.0，待培養(yǎng)18 h后甘油耗盡（溶氧陡然上升）后繼續(xù)補(bǔ)加約50%的甘油。誘導(dǎo)產(chǎn)酶階段溫度設(shè)定為25℃，pH設(shè)定為7.0，當(dāng)溶氧再一次上升時(shí)，流加甲醇至發(fā)酵液中進(jìn)行誘導(dǎo)，在發(fā)酵過程中適時(shí)調(diào)節(jié)甲醇流速使溶氧保持在20%以上，發(fā)酵過程中每隔12 h取樣測定酰基轉(zhuǎn)移酶活性。

    收集發(fā)酵罐菌體，12 000 r/min離心10 min，收集上清，用lOk膜超濾濃縮，將濃縮后的上清凍干，制成凍干粉，用于辛伐他汀酸合成實(shí)驗(yàn)。

    將莫那可林酸溶于pH8.5的400 mmol/L三乙醇胺緩沖溶液中，終濃度為60 mg/mL，待其完全溶解后加入凍干粉，使酶濃度達(dá)到7 mg/mL，攪拌10 min后加入一定量的活性炭，攪拌5 min，加入側(cè)鏈DMB-S-MMP，其終濃度為0.044%，反應(yīng)總體積為100 mL左右，HPLC檢測辛伐他汀的生成。反應(yīng)結(jié)束，計(jì)算莫那可林酸轉(zhuǎn)化率：（初始投入反應(yīng)時(shí)莫那可林酸的含量一莫那可林酸的剩余含量）/初始投入反應(yīng)時(shí)莫那可林酸的含量。

2結(jié)果

2.1    LovD基因的PCR擴(kuò)增

    根據(jù)LovD基因序列及畢赤酵母載體的多克隆位點(diǎn)分別設(shè)計(jì)了2組引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)8 g/L瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖1，擴(kuò)增到1200bp左右的條帶，其大小與預(yù)測結(jié)果一致。

2.2  重組表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K-LovD和pA0815-LovD的鑒定

    將重組質(zhì)粒pPIC9K-LovD用限制性內(nèi)切酶Not I /EcoR I雙酶切，將pA0815-LovD用EcoR I單酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，前者可見含1200bp左右的基因條帶和約9900 bp的載體條帶(圖2A)，后者可見含1200 bp左右的基因條帶和約7700 bp的載體條帶（圖2B），說明目的基因已成功插入載體。測序結(jié)果證明插入位點(diǎn)正確且無突變。

2.3  重組畢赤酵母菌的搖瓶表達(dá)及活性測定

    分別挑選8株陽性重組酵母菌，在BMGY培養(yǎng)基中進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，誘導(dǎo)72 h后測定其合成的辛伐他汀的活性。結(jié)果顯示，胞外表達(dá)菌和胞內(nèi)表達(dá)菌各重組子之間的酶活力無明顯差異，將各重組子的酶活取平均值如圖3所示，胞外重組酵母菌的酶活是胞內(nèi)重組酵母菌的近3倍，其合成的辛伐他汀的酶活可達(dá)52 U/L，說明畢赤酵母的胞外表達(dá)系統(tǒng)更適合LovD。

2.4胞外表達(dá)重組酵母菌株發(fā)酵罐放大實(shí)驗(yàn)

    以篩選到的高酶活胞外表達(dá)重組子為出發(fā)菌株，接種到150 mL YPD液體培養(yǎng)基中，28C過夜培養(yǎng)，制成種子液，然后以5%的接種量接人3L的BMGY( pH8.0)液體培養(yǎng)基（SL發(fā)酵罐）中，誘導(dǎo)96 h時(shí)，發(fā)酵液中酶活達(dá)到了最大值，為609.3 U/L，隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長，酶活力趨于穩(wěn)定（圖4），因此確定96 h為搖瓶發(fā)酵最佳誘導(dǎo)時(shí)問。

2.5  LovD的功效實(shí)驗(yàn)

    重組酵母菌株菌液經(jīng)收集、濃縮、制成凍干粉，用于辛伐他汀合成，經(jīng)過45 h反應(yīng)后，結(jié)果如圖5所示。反應(yīng)結(jié)束時(shí)，莫那可林酸的轉(zhuǎn)化率可達(dá)96%，酵母表達(dá)的LovD可很好地催化莫那可林酸生成辛伐他汀，反應(yīng)物中的雜質(zhì)較少。

3討論

國內(nèi)外學(xué)者已對(duì)LovD的原核異源表達(dá)進(jìn)行了一些研究，其出發(fā)基因序列均為土曲霉來源的�；�轉(zhuǎn)移酶氨基酸序列。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)行了突變等研究。2007年，Xie等通過構(gòu)建的大腸桿菌BL21( DE3)/pAW31表達(dá)菌株，進(jìn)行了全細(xì)胞催化莫納克林酸生成辛伐他汀的實(shí)驗(yàn)探索，底物濃度為5 g/L時(shí)轉(zhuǎn)化率達(dá)gg%，產(chǎn)品濃度可達(dá)98%。但其僅為小試實(shí)驗(yàn)，并無后期放大化實(shí)驗(yàn)結(jié)果。2010年，華東理工大學(xué)的朱麗平在該研究基礎(chǔ)上，從多個(gè)方面對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，提高大腸桿菌BL21菌株中的酰基轉(zhuǎn)移酶LovD的表達(dá)，最終酶活僅為250 U/L，辛伐他汀合成轉(zhuǎn)化率為90%。本研究中LovD基因來源于實(shí)驗(yàn)室進(jìn)化保存，區(qū)別于上述學(xué)者的突變位點(diǎn)。本研究中底物濃度為60 g/L時(shí)，轉(zhuǎn)化率達(dá)到了96%以上，具備工業(yè)化應(yīng)用指標(biāo)。研究發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌內(nèi)存在可降解側(cè)鏈DMB-S-MMP的未知酶，因此產(chǎn)物中含有側(cè)鏈的分解產(chǎn)物DMB-S-MPA，不利于后續(xù)分離。本研究所構(gòu)建的畢赤酵母胞外工程菌株，由于其自身蛋白分泌較少，雜蛋白較少，用于催化辛伐他汀合成實(shí)驗(yàn)不會(huì)造成對(duì)側(cè)鏈的降解，因此產(chǎn)物的雜質(zhì)較少，利用后續(xù)純化，且產(chǎn)物收率高，可克服大腸桿菌發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)中存在自身蛋白表達(dá)多、后處理較為復(fù)雜，特別是在氣候條件、溫度濕度等方面也較為敏感，易被噬菌體感染等問題。在后續(xù)的工業(yè)化生產(chǎn)中，炯臺(tái)只楚藥業(yè)已利用本公司開發(fā)的相關(guān)酶進(jìn)行了辛伐他汀工業(yè)化生產(chǎn)驗(yàn)證，其產(chǎn)品純度達(dá)到了99%以上。因此，本研究所構(gòu)建的畢赤酵母工程菌，為LovD的表達(dá)提供了一條新途徑，為生物法合成辛伐他汀工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。

4[摘  要]  目的：構(gòu)建并篩選高效表達(dá)洛伐他汀�；�轉(zhuǎn)移酶( LovD)的畢赤酵母重組菌株。方法：將突變的LovD基因克隆到畢赤酵母胞外表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K和胞內(nèi)表達(dá)質(zhì)粒pA0815中，將重組表達(dá)質(zhì)粒電轉(zhuǎn)入畢赤酵母GS115中，得到畢赤酵母重組菌株，通過搖瓶發(fā)酵篩選高酶活力的重組菌株；在此基礎(chǔ)上，研究重組菌在5L發(fā)酵罐中的高密度發(fā)酵，并將所得酶液進(jìn)行辛伐他汀催化反應(yīng)。結(jié)果：pPIC9K-LovD胞外表達(dá)重組菌的酶活是pA081 5-LovD胞內(nèi)表達(dá)重組菌的3倍。篩選到酶活高的pPIC9K-LovD-3菌株進(jìn)行5L發(fā)酵罐放大實(shí)驗(yàn)，經(jīng)過96 h的甲醇誘導(dǎo)表達(dá)，酶活可達(dá)609.3 μL；發(fā)酵所得酶液凍干后進(jìn)行酶功效實(shí)驗(yàn)，反應(yīng)45 h后，其底物轉(zhuǎn)化率可達(dá)96c70以上。結(jié)論：構(gòu)建的畢赤酵母胞外表達(dá)菌株可高效表達(dá)洛伐他汀�；�轉(zhuǎn)移酶，培養(yǎng)液上清雜蛋白較少，有利于后續(xù)分離和純化，為洛伐他汀酰基轉(zhuǎn)移酶的工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。