關(guān)于玉米秸稈真菌降解液生產(chǎn)燃料乙醇的發(fā)酵條件優(yōu)化的研究
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作者：鄭曉敏
農(nóng)作物秸稈在我國較為廉價且資源豐富，年產(chǎn)近7億t，但這些資源卻未被充分利用，且常因就地焚燒而污染環(huán)境。另一方面我國石油資源有限，是世界第二大石油進(jìn)口國，僅2013年就進(jìn)口3.78億t。因此，發(fā)展生物燃料乙醇技術(shù)對我國更有意義。目前制約纖維素乙醇商業(yè)化的主要瓶頸是乙醇轉(zhuǎn)化率不高，生產(chǎn)成本較高，與糧食乙醇相比沒有優(yōu)勢。本研究利用真菌對玉米秸稈進(jìn)行降解，用釀酒酵母對真菌降解液進(jìn)行乙醇發(fā)酵，并優(yōu)化了影響乙醇產(chǎn)率的主要因素，為以玉米秸稈為原料制取燃料乙醇提供一定的依據(jù)。
1材料與方法
1.1材料
1.1.1玉米秸稈
玉米秸稈取白包頭市郊區(qū)農(nóng)田，粉碎成3 mm以下的顆粒，洗凈烘干，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.75%的稀硫酸在121℃下處理th，水洗至中性，干燥后備用。
1.1.2發(fā)酵菌種
綠色木霉、黑曲霉、新月彎孢霉和釀酒酵母均由本實(shí)驗(yàn)室儲藏。
1.1.3培養(yǎng)基
基礎(chǔ)液體發(fā)酵培養(yǎng)基：40 g經(jīng)過預(yù)處理的秸稈，KH2P04 0.5 g,MgS04 -7H20 0.1 g,NaCl 6.0 g,K2HP04 2.0 g，(NH)4S04 2.0 g．VB1微量，pH自然，加水定容至1 000 mL。分裝于250 mL三角瓶，121℃下滅菌30 min。
液體PDA培養(yǎng)基：葡萄糖20 g，KH2P043 g，MgS04-7H20 1.5 g，馬鈴薯200 g煮汁，VB1微量，定容至1 000 mL，pH自然；121 0C下滅菌30 min。
酵母培養(yǎng)基：酵母膏10 g，蛋白粉20 g，葡萄糖20 g，定容至1 000 mL。分裝于150 mL三角瓶，121℃下滅菌30 min。
1.2方法
1.2.1種子液制備
將綠色木霉、黑曲霉、新月彎孢霉和釀酒酵母分別接種到液體PDA培養(yǎng)基和酵母培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)，菌懸液作為種子。
1.2.2秸稈降解
將綠色木霉、黑曲霉、新月彎孢霉種子液按不同方式接種到基礎(chǔ)液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，在溫度為28℃，搖床轉(zhuǎn)速為150 r/min條件下進(jìn)行秸稈降解。分別在第3，5，7，9天測定培養(yǎng)液中纖維素酶酶活。
①單一菌株培養(yǎng)降解秸稈
將綠色木霉、黑曲霉、新月彎孢霉種子液分別按10%接種量接種至基礎(chǔ)液體發(fā)酵培養(yǎng)基中。
②混菌培養(yǎng)降解秸稈
將綠色木霉和黑曲霉種子液分別按5%接種量接種至基礎(chǔ)液體發(fā)酵培養(yǎng)基中。
將綠色木霉和新月彎孢霉種子液分別按5%接種量接種至基礎(chǔ)液體發(fā)酵培養(yǎng)基中。
將黑曲霉和新月彎孢霉種子液分別按5%接種量接種至基礎(chǔ)液體發(fā)酵培養(yǎng)基中。
將綠色木霉、黑曲霉和新月彎孢霉種子液分別按3.5%接種量接種至基礎(chǔ)液體發(fā)酵培養(yǎng)基中。
1.2.3乙醇發(fā)酵
將冰箱中保藏的釀酒酵母進(jìn)行活化，活化后接人到酵母培養(yǎng)基培養(yǎng)種子，取種子培養(yǎng)液按一定比例的接種量接人到發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行乙醇發(fā)酵，間隔一定時間檢測乙醇濃度。
1.2.4分析方法
發(fā)酵液經(jīng)過濾離心后，取2 mL上清液，經(jīng)0.45um微孔濾膜過濾，采用氣相色譜法測定乙醇含量。采用3，5二硝基水楊酸(DNS)法測定還原糖含量。
2結(jié)果與分析
2.1降解秸稈真菌的選擇
采用單一真菌及多種真菌組合的秸稈降解物中纖維素酶酶活測量結(jié)果如圖1所示，其中，只有新月彎孢霉純培養(yǎng)降解秸稈時酶活高峰出現(xiàn)在第3天，但酶活力最低；其它6種降解方式酶活高峰均出現(xiàn)在第5天，綠色木霉和黑曲霉混菌培養(yǎng)的降解液酶活最高，因此，優(yōu)化試驗(yàn)選取綠色木霉和黑曲霉混合培養(yǎng)降解液。新月彎孢霉純培養(yǎng)產(chǎn)酶低可能是由于其比較容易利用青玉米葉片營養(yǎng)成分，對以枯黃玉米稈為主的秸稈成分利用率較低。而綠色木霉和黑曲霉產(chǎn)纖維素酶較高，降解產(chǎn)生還原糖后可能會抑制產(chǎn)物的形成，降低了纖維素酶的分泌，另外，由于震蕩剪切等因素導(dǎo)致酶蛋白變性失活，因此酶活高峰出現(xiàn)在第5天。
2.2降解時間對乙醇含量的影響
酵母發(fā)酵依賴于纖維素降解菌降解秸稈后產(chǎn)生的還原糖。因此，將綠色木霉和黑曲霉分別以5%的接種量接種到基礎(chǔ)液體發(fā)酵培養(yǎng)基，在第48，72，96，120，144 h分別加入酵母，發(fā)酵24 h后測定乙醇含量，結(jié)果如圖2所示。從圖2可以看出，在降解120 h后加入酵母，乙醇產(chǎn)量最高，達(dá)到了10.14 mg/mL，乙醇產(chǎn)率（乙醇質(zhì)量與總糖質(zhì)量之比）為0.29 g/g，為最大理論值的56.86%。
2.3加入酵母后發(fā)酵時間對乙醇含量的影響
圖3為降解液在加入酵母（接種量為10%）12，24，36，48，60，72 h后分別測定的乙醇含量。從圖3可以看出，發(fā)酵前24 h乙醇產(chǎn)量增長較快，在發(fā)酵第24 h乙醇含量達(dá)到最高值10.60mg/mL，乙醇產(chǎn)率為0.30 g/g，為最大理論值的58.82%，此后乙醇含量增加很小。因此選取投加酵母后發(fā)酵24 h為最適發(fā)酵時間。
2.4酵母的接種量對乙醇含量的影響
將酵母種子液分別以5%，10%，15%，20%，25%的接種量加入到降解液中，在發(fā)酵第24 h測定乙醇含量，結(jié)果如圖4所示。從圖4可以看出，酵母的接種量為15 %時乙醇含量達(dá)到最高值，為10.91 mg/mL，乙醇產(chǎn)率為0.31 g/g，為最大理論值的60.78%。
2.5培養(yǎng)溫度對乙醇含量的影響
以15%的接種量將酵母接種到降解液中，分別在25，28，31，34，37℃發(fā)酵24 h，測定乙醇含量，結(jié)果如圖5所示。從圖5可以看出，在28℃時乙醇含量最高，達(dá)到11.43 mg/mL，乙醇產(chǎn)率為0.33 g/g，為最大理論值的64.71%。
2.6發(fā)酵液初始pH對乙醇含量的影響
以15%的接種量將酵母接種到初始pH分別為3.5，4.0，4.5，5.0，5.5 ,6.0，6.5的降解液中，在28℃發(fā)酵24 h．測定乙醇含量，結(jié)果如圖6所示。從圖6可以看出，在初始pH為3.5—5.5的發(fā)酵液中，釀酒酵母發(fā)酵乙醇產(chǎn)量處在較高水平，乙醇含量最高可達(dá)到11.85 mg/mL，乙醇產(chǎn)率為0.34 g/g，為最大理論值的66.67%。初始pH高于5.5時，乙醇含量下降較多。
3結(jié)論
利用綠色木霉和黑曲霉聯(lián)合對玉米秸稈進(jìn)行降解的效果要好于采用單一菌種和其它菌種組合。在降解時間為120 h后加入酵母，乙醇產(chǎn)量最高，達(dá)到了10.14 mg/mL，乙醇產(chǎn)率為0.29 g/g，為最大理論值的56.86%。
對玉米秸稈降解液生產(chǎn)乙醇的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，確定了最佳發(fā)酵條件：降解液加入酵母后的發(fā)酵時間為24 h，酵母的接種量為15%．發(fā)酵溫度為28℃，發(fā)酵液初始pH為3.5—5.5時，乙醇產(chǎn)量最高值可達(dá)11.85 mg/mL，乙醇得率由56.86%提高至66.67%。
4摘要：該研究利用一種真菌純培養(yǎng)和多種真菌混合培養(yǎng)降解玉米秸稈產(chǎn)生可發(fā)酵糖，并對秸稈生物降解液進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)乙醇，同時研究了玉米秸稈生物降解液發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的最佳條件。結(jié)果表明：采用綠色木霉和黑曲霉混合培養(yǎng)降解秸稈時的纖維素酶活力高于其它6種降解方式；利用綠色木霉和黑曲霉組成的混合菌對秸稈進(jìn)行降解后得到的降解液生產(chǎn)乙醇，在秸稈降解時間為120 h，酵母發(fā)酵時問為24 h，酵母接種量為15%，溫度為28℃，初始pH為3.5—5.5時保持較高的乙醇產(chǎn)率，乙醇含量最高值可達(dá)11.85 mg/mJ。，乙醇得率由56.86c7c,提高至66.67%。
