一種 APMP廢水生物降解茵群
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作者：張毅
目前對(duì)生物處理過(guò)程中高效菌種的研究也越來(lái)越多，趙建篩選出可用于造紙廢水處理的抗性菌株，出水COD和色度都穩(wěn)定在一個(gè)比較好的水平，科研人員利用構(gòu)建的優(yōu)勢(shì)降解菌群強(qiáng)化好氧顆粒污泥，提高制漿廢水的降解效果，在厭氧處理的基礎(chǔ)上，對(duì)原始好氧污泥處理后，廢水CODcr由629 mg/L降至203 mg/L，廢水色度由118 C．U．降至91 C．U.；而強(qiáng)化好氧污泥處理后，廢水CODcr由629 mg/L降至146 mg/L，廢水色度由118 C．U．降至72 C．U．。生物法處理制漿廢水的關(guān)鍵是提高微生物對(duì)有機(jī)物的降解效率，篩選得到高效降解菌從而優(yōu)化降解菌群。本研究將從污泥和APMP廢水中提取出細(xì)菌，并篩選出高效菌株對(duì)其進(jìn)行組合，找出降解效果最優(yōu)的高效菌株的組合方式，達(dá)到高效處理APMP廢水的目的。
1實(shí)驗(yàn)
1.1原料
實(shí)驗(yàn)菌種：從好氧活性污泥和APMP廢水中篩選菌株。
實(shí)驗(yàn)廢水：楊木APMP綜合廢水，pH值為9.O，CODcr含量為6960 mg/L，BODs含量為2920 mg/L。BODs:CODcr=0.42，大于0.3，可生化性較強(qiáng)。
1.2培養(yǎng)基
無(wú)機(jī)鹽溶液：KH2P04 420 mg/L，K2HP04 375mg/L, (NH4)2S04 244 mg/L, NaC130 mg/L, CaCl2 30mg/L, MgS04 -H20 30 mg/L, FeCl3 -6H20 3 mg/L。
磷酸緩沖液( PBS)：NaCI 8g/L，KCl O．2 g/L，KH2P04 0.2g/L, K2HP04 1.15 g/L。
LB液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10 g/L。
LB固體培養(yǎng)基：在LB液體培養(yǎng)基中加入2%的瓊脂粉。
以上試劑均在121℃條件下滅菌15 min。
1.3菌株的篩選
無(wú)菌操作條件下，用移液槍分別從好氧污泥和APMP廢水中取50 μL，轉(zhuǎn)入10 mL、50 mL、100 mL無(wú)菌水中進(jìn)行梯度稀釋，將稀釋后的廢水涂布于3個(gè)分離平板上（LB固體培養(yǎng)基），30CC條件下靜置培養(yǎng)36 h。
根據(jù)菌落生長(zhǎng)的稀密程度，確定最佳稀釋濃度的分離平板，再以菌落的形貌為特征，從分離平板上選取不同菌落，采用劃線稀釋法將單一菌落接種于新分離平板上，以進(jìn)一步篩選純菌株，放入細(xì)菌培養(yǎng)箱，300C條件下靜置培養(yǎng)36 h。將生長(zhǎng)出來(lái)的菌落再次接種于斜面固體培養(yǎng)基中，靜置培養(yǎng)36 h后，4℃保藏備用。
1.4菌株的擴(kuò)大培養(yǎng)及菌體收集
將分離的菌株分別接種于LB液體培養(yǎng)基中，30℃條件下振蕩培養(yǎng)(150 r/min)，待到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，將包含菌體的培養(yǎng)液倒入150 mL經(jīng)滅菌處理的離心管（121℃條件下滅菌20 min）中，5000 r/min條件下離心10 min，棄上清液，PBS緩沖液洗滌2次，收集菌體備用。
1.5菌體形態(tài)的微觀觀察
無(wú)菌操作下取出目標(biāo)菌體，-80℃條件下冷凍干燥8h，噴金后
《中國(guó)造紙》2016年第35卷第1期利用掃描電子顯微鏡( SEM，JSM 5600 LV)觀察各菌體的微觀形態(tài)。
1.6菌株生長(zhǎng)曲線的測(cè)定
微生物懸浮液中的菌體對(duì)透過(guò)菌株懸浮液的光線具有吸收作用，在一定范圍內(nèi)，菌懸液中微生物的細(xì)胞濃度與透過(guò)的光密度成正比，因此可以利用該原理測(cè)量樣品溶液中的光密度，以此來(lái)代表菌株的生長(zhǎng)曲線。
將篩選出的菌株在30℃、140 r/min的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，在600 nm下采用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定菌液的光密度值（OD600）。初始加入菌株的OD600為0.2，每隔4h檢測(cè)其光密度值，當(dāng)OD600不再增長(zhǎng)時(shí)，停止檢測(cè)。
1.7 APMP廢水有機(jī)污染物的生物降解
分別取150 mL APMP廢水至300 mL錐形瓶中，調(diào)節(jié)pH值為7.0，在121℃條件下滅菌20 min。將擴(kuò)大培養(yǎng)后的菌株投加至廢水中，使其在廢水中的光密度值( OD600)為0.2，30C下振蕩培養(yǎng)(150 r/min)，每隔6h取水樣5 mL檢測(cè)其COD值，至COD值不再下降時(shí)結(jié)束實(shí)驗(yàn)。
1.8廢水的COD檢測(cè)
采用重鉻酸鉀法進(jìn)行測(cè)定。
1.9優(yōu)勢(shì)菌群篩選實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)
運(yùn)用部分因子設(shè)計(jì)( FFD)優(yōu)化，通過(guò)Minitab軟件對(duì)部分因子及全因子設(shè)計(jì)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析。
2結(jié)果與討論
2.1從廢水和污泥中篩選降解菌
將APMP廢水和活性污泥適當(dāng)稀釋后涂布于LB固體培養(yǎng)基中，放入3℃培養(yǎng)箱，靜置培養(yǎng)36 h，觀察菌株生長(zhǎng)情況，如圖1所示。由圖1可知，平板上生長(zhǎng)出不同的微生物菌落，它們?cè)诰渖珴�、質(zhì)地、形狀、表面粗糙度等形貌特征方面存在明顯差異。將不同菌落采用劃線稀釋法重新接種于分離平板上，進(jìn)一步純化菌株。
對(duì)取自APMP廢水和好氧活性污泥中的菌株進(jìn)行篩選、分離，總共得到了11株的微生物菌體，其中6種來(lái)自APMP制漿廢水(Wl、W2、W3、W4、W5、W7)，5種來(lái)自好氧活性污泥(Sl、S3、S4、S5、S6)。
2.2菌株個(gè)體微觀形態(tài)的觀察
掃描電鏡能夠觀察到菌株的個(gè)體外觀形態(tài)、長(zhǎng)度、寬度等基本特征，從而能夠更好地分析篩選出來(lái)的菌株。各菌株的基本特征見(jiàn)表1。
圖2是從APMP廢水和好氧活性污泥中篩選出來(lái)的菌株的SEM圖片。由表1和圖2可知，11種菌株的長(zhǎng)度范圍為1.5～7μm，除W5、S3的寬度為0.5、2μm以外，大部分菌株的寬度為1μLm左右，Wl、Sl的外觀形態(tài)相同，都是長(zhǎng)棒狀，前后粗細(xì)均勻，其余的9種菌株在外觀形態(tài)方面各不相同，因此可以斷定篩選出的1 1種菌株屬于不同的菌種。
2.3菌株對(duì)APMP廢水COD的去除效果
不同菌株對(duì)APMP廢水COD的去除效果如表2所示。由表2可知，在篩選出的11株菌中，降解能力由大到小依次是：S4>W7>W2>Sl>S6>S5>S3> W4>W3>Wl>W5。其中，S4的降解效果最佳，處理120 h后，APMP廢水CODcr由6960 mg/L降至3351 mg/L，去除率達(dá)到51.9%；菌株W7處理APMP廢水120 h后，CODcr由6960 mg/L降至3445mg/L，去除率達(dá)到50.5%，菌株W2的CODcr去除率也高達(dá)50%。
根據(jù)各菌株在不同時(shí)間段的吸光度可知，W3、Sl、S3、S6基本沒(méi)有生長(zhǎng)，OD600在0.2左右徘徊，因此不適宜用作處理APMP廢水的高效菌株，并且W5的生長(zhǎng)狀況良好，較Wl有生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)，再根據(jù)表2各菌株對(duì)廢水的處理效果，篩選出W2、W4、W5、W7、S4、S5這6種高效降解菌。
圖3為這6種菌株對(duì)APMP廢水COD的去除情況。從圖3可以看出，大多數(shù)菌落在第120 h左右時(shí)的去除效果最好，因?yàn)榇藭r(shí)大多數(shù)菌落處于穩(wěn)定期，增長(zhǎng)速度很快，所以降解效果最好�？偟膩�(lái)說(shuō)，隨著時(shí)間的增長(zhǎng)CODcr是不斷降低的，然后保持穩(wěn)定或略有增長(zhǎng)。因?yàn)樵诜�(wěn)定期細(xì)菌的生長(zhǎng)和死亡呈動(dòng)態(tài)平衡，所以CODcr基本不變，略有增長(zhǎng)的原因是因?yàn)榧?xì)菌死亡的速度大于生長(zhǎng)速度。
2.4菌株生長(zhǎng)曲線
菌株在一種溶液中的生長(zhǎng)發(fā)育狀況可以通過(guò)菌株的生長(zhǎng)曲線來(lái)了解，菌株的4個(gè)生長(zhǎng)周期分別為隱晦期、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、穩(wěn)定期和衰亡期，通過(guò)菌株生長(zhǎng)曲線的測(cè)量，可以推測(cè)菌株在不同時(shí)間的生長(zhǎng)狀況。一般處理廢水大都采用處于穩(wěn)定期的菌株，這個(gè)時(shí)期菌株的數(shù)量和周?chē)h(huán)境達(dá)到了一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡，能夠平穩(wěn)地降低廢水中的污染物質(zhì)，從而達(dá)到降低廢水COD的目的。
由圖4各菌株的生長(zhǎng)曲線圖可知，W4、W5、W7、S4有著相似的生長(zhǎng)規(guī)律，接種后的O～36 h為隱晦期，36～56 h為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，菌落開(kāi)始快速增長(zhǎng)，56～96 h為穩(wěn)定期，細(xì)菌的生長(zhǎng)和死亡呈動(dòng)態(tài)平衡；S5、W2細(xì)菌的增長(zhǎng)速度很快，接種后即開(kāi)始增長(zhǎng)，0~28 h為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，其后一直保持著穩(wěn)定的增長(zhǎng)速度，60~96 h為穩(wěn)定期，細(xì)菌的生長(zhǎng)和死亡呈動(dòng)態(tài)平衡。
2.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法構(gòu)建APMP制漿廢水優(yōu)勢(shì)降解菌群
以W2、W4、W5、W6、S3、S4這6株菌作為分析因子，最高CODcr去除率（Rmax）為響應(yīng)做6因素2水平的部分因子設(shè)計(jì)( FFD)實(shí)驗(yàn)，用于評(píng)估單株菌及混合菌對(duì)廢水COD去除的影響，變量值如表3所示。
6因素全因子分析需要64 (26)組實(shí)驗(yàn)來(lái)評(píng)估主效應(yīng)和交互效應(yīng)，在本研究中，為減少工作量，選用部分因子分析設(shè)計(jì)，由16種實(shí)驗(yàn)構(gòu)成的設(shè)計(jì)方案，在設(shè)計(jì)方案中，實(shí)驗(yàn)順序隨機(jī)排列，實(shí)驗(yàn)順序詳細(xì)信息及響應(yīng)值Rmax見(jiàn)表4。
圖5為不同菌株或菌株聯(lián)合對(duì)廢水COD去除率的正態(tài)概率圖。在圖4中對(duì)響應(yīng)即COD去除率有顯著影響的因子離正態(tài)概率線較遠(yuǎn)，這些影響因子對(duì)COD降解有重要貢獻(xiàn)；對(duì)響應(yīng)沒(méi)有顯著影響的因子離正態(tài)概率線較近，這些較近的點(diǎn)的影響可以忽略不計(jì)。
因此從圖5可以看出，單變量W4、S4和S5對(duì)廢水COD的去除有重要意義。此外，在這個(gè)模型中有3種顯著的交互作用，分別是XlX4、XlX2和XlX2X6。在這3種顯著的交互作用中，XlX4和Xl X2X6對(duì)Rmax產(chǎn)生積極的影響，而X1X2則有消極的影響。通過(guò)運(yùn)用多元回歸分析對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析并且忽略那些95%置信區(qū)間內(nèi)不顯著條件，從FFD中可以獲得一個(gè)一價(jià)模型方程：
Rmax=32.64+7.77X2+9.15Xs+6.47X6+3. 29XIX4 -4.llXIX2 +3. 31XIX2X6
從方程中可以看出，Xi (W2)、X2 (W4)、X4( W7)、X5(S4)和X6 (S5)對(duì)APMP制漿廢水
COD的降解都有不同程度的影響，而X3（W5）對(duì)廢水COD的降解沒(méi)有顯著影響。因此，可選出W2、W4、W7、S4和S5這5株菌構(gòu)建APMP制漿廢水的優(yōu)勢(shì)降解菌群。
3結(jié)論
3.1 利用稀釋倍數(shù)法和劃線稀釋法，從APMP制漿廢水和好氧污泥中共篩選純化出11株菌株，根據(jù)各菌株在掃描電鏡下的圖片分析其基本特征，并結(jié)合COD去除效果和生長(zhǎng)曲線圖篩選出W2、W4、W5、W7、S4、S5這6種高效降解菌。其中S4的降解效果最佳，處理APMP廢水120 h后，CODcr由6960mg/L降至3351 mg/L，去除率達(dá)到51. 9%；菌株W7處理APMP廢水120 h后，CODcr由6960 mg/L降至3445 mg/L，去除率達(dá)到50. 5%；菌株W2的去除率也高達(dá)50. O%。
3.2 以6株菌株為出發(fā)菌株用于降解APMP制漿廢水中的有機(jī)污染物，先通過(guò)部分因子設(shè)計(jì)( FFD)實(shí)驗(yàn)，再運(yùn)用多元回歸分析，菌株W2、W4、W7、S4和S5是影響APMP廢水降解有機(jī)污染物的主要因素，可用于構(gòu)建針對(duì)APMP廢水的優(yōu)勢(shì)降解菌群。摘要：從APMP廢水及好氧污泥中篩選出11株微生物菌株，并檢測(cè)它們降解APMP廢水中有機(jī)污染物的能力。結(jié)果顯示，菌株W2、W4、W5、W7、S4、S5具有較強(qiáng)的有機(jī)污染物降解能力，其中，菌株s4的降解效果最佳，處理APMP廢水120 h后，CODer由6960 mg/L降至3351 mg/L，去除率達(dá)到51.9%。以這6株菌為出發(fā)菌株，結(jié)合統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，采用6因素2水平的部分因子設(shè)計(jì)(FFD)實(shí)驗(yàn)，以最高CODcr去除率為響應(yīng)值，考察單因素作用及多因素相互作用對(duì)廢水降解的影響。結(jié)果表明，菌株W2、W4、W7、S4和s5是影響APMP廢水有機(jī)污染物降解的主要因素，可用于構(gòu)建針對(duì)APMP廢水的優(yōu)勢(shì)降解菌群。
