發(fā)酵法精制大豆糖蜜中功能性低聚糖工藝的研究
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劉飛，李相昕，葛洪如，齊小芬，于殿宇*
東北農(nóng)業(yè)大學(xué)（哈爾濱150030）
摘要試驗研究發(fā)酵法制備大豆糖蜜中功能性低聚糖的工藝。首先對大豆糖蜜的主要成分進(jìn)行了分析和測定，大豆糖蜜中糖分含量占總量的48.48%。試驗研究了5種不同的酵母對糖蜜中蔗糖去除效果和功能性低聚糖的保留率，選擇啤酒酵母103作為發(fā)酵菌種，通過單因素試驗考察pH、溫度、時間、糖蜜濃度和接種量對發(fā)酵效果的影響，再通過響應(yīng)面對工藝條件進(jìn)行優(yōu)化：pH 5,0、溫度33℃、時間11 h、糖蜜濃度4.0%、接種量3,1%。大豆糖蜜發(fā)酵液
中各糖分的保留率為：蔗糖10.3%、棉子糖81.0%、水蘇糖92.5%，獲得了功能性成分含量及純度均較高的大豆低聚糖產(chǎn)品。
關(guān)鍵詞發(fā)酵；低聚糖；響應(yīng)面；保留率
大豆糖蜜是以低溫脫脂豆粕為原料生產(chǎn)大豆?jié)饪s蛋白過程中經(jīng)溶劑萃取、濃縮而成的純天然副產(chǎn)物。大豆糖蜜中的主要成分為低聚糖，含量為59%~62%，此外還有少量粗蛋白、脂類物質(zhì)、灰分、大豆皂苷、大豆異黃酮、酚酸、果膠質(zhì)、阿拉伯半乳糖等多種糖類。通常說的功能性低聚糖是指具有特殊生理功能，特別是有利于雙歧桿菌增殖的—類低聚糖。
大豆低聚糖有很多有益的作用，如它能促進(jìn)人體內(nèi)的雙歧桿菌的增殖，從而提高人體結(jié)腸的健康情況、降血壓、增加壽命、降低膽同醇、減少結(jié)腸癌的發(fā)病率，由于大豆低聚糖有一些優(yōu)秀的加工性能和生理功能的特點，使其在食品工業(yè)中廣泛應(yīng)用。尤其是大豆低聚糖低熱值、低甜度的特點，它適用于保健食品，提高人民健康水平具有積極的作用。
從大豆糖蜜等原料中直接提取大豆低聚糖，往往因原料中蔗糖含量高，難分離，造成最終低聚糖產(chǎn)品蔗糖含量高，功能性成分含量較低，限制了其在一些特殊食品中的應(yīng)用，而微生物發(fā)酵后的大豆糖蜜，蔗糖被微生物大量消耗，功能性成分含量高。大豆糖蜜作為發(fā)酵底物的利用在國外已經(jīng)有很多報道。
試驗對發(fā)酵大豆糖蜜精制功能性低聚糖的微生物進(jìn)行篩選并對其發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化，以提高蔗糖的去除效果和功能性低聚糖的保留率，獲得功能性成分含量及純度均較高的大豆低聚糖產(chǎn)品，為大豆低聚糖生產(chǎn)與應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。
1 材料與方法
1.1材料與試劑
啤酒酵母101，啤酒酵母102，啤酒酵母103，假絲酵母，茶酵母由黑龍江省微生物研究所提供；大豆糖蜜由九三集團提供。
1.2儀器與設(shè)備
LC-VP高效液相色譜儀：日本島津；DHP-恒溫培養(yǎng)箱：上海實驗儀器廠有限公司；LPZX-50KB5立式壓力蒸汽滅菌器：上海一恒科技有限公司。
1.3方法
1.3.1培養(yǎng)基
培養(yǎng)基配制：蔗糖2%，蛋白胨2%，酵母膏1%;干酵母活化液：葡萄糖5%，(NH4)2S04 0.2%，
K2HPO40.1%，CaSO40.1%，檸檬酸0.1%，干酵母粉9.375 g；糖蜜發(fā)酵前的處理：將糖蜜稀釋一定濃度以滿足不同菌的生長，pH調(diào)制幾種菌的最適pH，將糖蜜稀釋到50BX，pH 5.0，115℃滅菌15 min。
1.3.2色譜條件
色譜柱：Kromasil 100氨基柱250 mm×4.6 mm（大連依利特科學(xué)儀器公司）；流動相：V乙腈）：V(水）：80：20；流速：1.0 m L．min-1;檢測器：示差折光檢測器（RID；柱溫：30 0C;檢測器溫度：30℃；進(jìn)樣量：10 μL
;天平分度值：0.000 1g；樣品制備：以超純水為溶劑配制質(zhì)量濃度為5 mg．mL-1的樣品，準(zhǔn)確記錄含量，過0.45μm 微孔膜。
1.3.3菌株的馴化
將活化好的菌株按4% 接種量分別接到不同比例的葡萄糖和蔗糖的培養(yǎng)基中，在28℃條件培養(yǎng)，待培養(yǎng)液凝固后再同一梯度傳代兩次。葡萄糖和蔗糖的比例分別是9:1，7:3，5：5.3：7和1：9，然后接種到下一梯度的培養(yǎng)基中，每次培養(yǎng)48 h，測活菌數(shù)和pH。使菌種適應(yīng)蔗糖的生長環(huán)境，以達(dá)到馴化的目的。由于試驗的最終目的是讓酵母菌適應(yīng)糖蜜這種高糖分的底物環(huán)境，所以需要將適應(yīng)蔗糖環(huán)境的一次馴化菌進(jìn)行二次馴化。按4%接種量接種到蔗糖為碳源的培養(yǎng)基和糖蜜（稀釋17倍）不同比例混合的培養(yǎng)集中進(jìn)行傳代培養(yǎng)，蔗糖培養(yǎng)基和糖蜜的比例是3:2，2:3，1:4和1:9，由糖蜜比例低濃度到高濃度，每一梯度馴化兩次，每次培養(yǎng)48 h，然后再接種到下一梯度，最終達(dá)到酵母菌適應(yīng)糖蜜的生長環(huán)境的目的。
2結(jié)果和分析
2.1微生物發(fā)酵法精制大豆低聚糖菌株的篩選
2.1.1采用高效液相色譜對糖蜜進(jìn)行檢測分析
采用高效液相色譜法對大豆糖蜜的低聚糖含量進(jìn)行分析，最終確定大豆糖蜜中低聚糖含量情況如表1。
由表1可以算出蔗糖、棉子糖和水蘇糖占總糖含量分別是58.90%，8.15 %和31.27%。三種糖含量占總糖的98.31%，說明糖蜜中除了上述三種糖外，還有微量的其他糖分。大豆糖蜜中非功能性的蔗糖，大大降低了大豆糖蜜中低聚糖的功能性，所以去除糖蜜中的蔗糖是非常必要的。目前能有效去除大豆糖蜜中蔗糖的方法是十分困難的，蔗糖和棉子糖、水蘇糖分子量差距很小，用膜分離、凝膠層析等方法很難將其分離，一些可以將其分離的方法價格昂貴，不適合工業(yè)化生產(chǎn)。采用了生物降解的方法，用微生物將蔗糖分解掉，避免了設(shè)備分離所帶來的困難。生物降解首先要考察微生物在蔗糖下的生長情況，如果微生物生長迅速，說明該菌對蔗糖有耐受性，為進(jìn)一步的大豆糖蜜發(fā)酵提供保障。
2.1.2菌種的選擇
將五種酵母菌接種到大豆糖蜜中，酵母干重均隨著發(fā)酵時間的延長而增長，表明酵母生長情況良好。但是單純對酵母菌的生長情況的考察也是不全面的，應(yīng)該還要對五種酵母菌對蔗糖、棉子糖和水蘇糖的分解情況進(jìn)行分析，篩選出一種或兩種既可以在高濃度的蔗糖下生長良好，同時也要對蔗糖的降解能力強的菌，進(jìn)行后續(xù)大豆糖蜜的發(fā)酵。發(fā)酵液中蔗糖、棉子糖和水蘇糖的保留率見表2。
從表2可以看出，酵母菌101、假絲酵母及茶酵母易造成功能性低聚糖的損失。酵母菌102純化大豆低聚糖的效果較好，但是所需的發(fā)酵時間較長。酵母菌103在4h時就把蔗糖全部消耗掉了，并且棉子糖和水蘇糖的殘?zhí)橇慷枷鄬^高，且由于大豆糖蜜中水蘇糖的含量比棉子糖含量高幾倍，因此水蘇糖殘?zhí)橇吭礁咴胶谩＝Y(jié)合以上分析，研究選擇酵母菌103作為發(fā)酵法純化大豆乳清的菌種。但是相對來說，酵母菌103有個缺點，即在沒有蔗糖和其他的糖存在時，比較容易利用功能性低聚糖作為碳源。所以更需要嚴(yán)格控制發(fā)酵時間。
2.2單因素試驗
2.2.1 發(fā)酵pH的確定
將酵母103接種于酵母種子培養(yǎng)基中，30 0C培養(yǎng)48 h，然后將種子活化液分別接種于稀釋10倍不同pH的大豆糖蜜發(fā)酵液中，接種量4%，同樣條件下培養(yǎng)然后HPLC分析糖分變化。
試驗選擇的pH是在3～7之間，因為酵母菌發(fā)酵糖蜜過程中偏酸性效果較好，但是pH在3以下對低聚糖的穩(wěn)定性有影響了，為了保持低聚糖的穩(wěn)定性，所以選擇了以下的pH梯度。
由圖1可知，不同pH對酵母發(fā)酵的影響較大，雖然酵母103對蔗糖的分解能力很強，但是不同pH下，水蘇糖和棉子糖的保留率是不同的，培養(yǎng)過程中蔗糖都已經(jīng)被完全分解掉，而pH 5.0時水蘇糖、棉子糖的保留率相對較高，所以最適的pH為5.0。
2.2.2發(fā)酵溫度的確定
配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的大豆糖蜜水溶液，接入4%的液體種子，調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH至5.0，分別在27℃，30℃．33℃．36℃和39℃下，在150 r/min恒溫振蕩箱中發(fā)酵48 h后，取樣測定大豆低聚糖含量，計算低聚糖保存率，結(jié)果如圖2所示。
由圖2可知，在30℃～36℃溫度范圍內(nèi)，糖蜜發(fā)酵液中3種糖的保存率變化不大，溫度在33℃時，蔗糖被較好地利用，棉籽糖和水蘇糖也有較好的保存率。因此，選擇發(fā)酵溫度33℃較適宜。
2.2.3發(fā)酵時間的確定
配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的大豆糖蜜水溶液，接人4%的液體種子，調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH至5.0，發(fā)酵溫度28℃，在130 r/min恒溫氣浴振蕩箱中，發(fā)酵培養(yǎng)不同的時間（7，9，11，13和15 h）后，取樣測定大豆低聚糖含量，計算低聚糖保存率，結(jié)果如圖3所示。
由圖3可知，發(fā)酵時間對于蔗糖保存率呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)，隨著發(fā)酵時間的延長，棉籽糖和水蘇糖的保存率都有所下降，造成功能性組分的損失。在發(fā)酵過程的前11 h，蔗糖得到有效的利用，表現(xiàn)為曲線斜率較大，發(fā)酵時間11 h后，曲線趨于平緩，說明酵母菌數(shù)量達(dá)到一定程度之后，增加速度緩慢。因此，選擇最佳發(fā)酵時間為11h。
2.2.4發(fā)酵糖蜜濃度的確定
配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%，4%，6%，80%和10%的大豆糖蜜水溶液，接入4%的液體種子，調(diào)節(jié)發(fā)酵液的pH至5.0，發(fā)酵溫度33℃，在130 r/min恒溫振蕩箱中發(fā)酵11 h后，取樣測定大豆低聚糖含量，計算低聚糖保存率，結(jié)果如圖4所示。
由圖4可知，酵母對高濃度的糖蜜仍有很強的利用能力，3種糖的保存率曲線和糖蜜質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈現(xiàn)正相關(guān)，當(dāng)糖蜜質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%時，蔗糖利用率較好，棉籽糖和水蘇糖的保留率較高。因此，選擇最佳糖蜜質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%。
2.2.5 接種量的確定
配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8%的大豆糖蜜水溶液，接人2%，3%，4%，5%和6%的液體種子，調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH至5.0，發(fā)酵溫度28℃，在130 r/min恒溫振蕩箱中發(fā)酵12 h后，取樣測定大豆低聚糖含量，結(jié)果如圖5所示。
從圖5可知，隨著接種量的增加，蔗糖在大豆低聚糖中的相對含量呈下降趨勢，這對大豆低聚糖的純化是有利的，接種量超過4%以后，棉籽糖和水蘇糖的降解速率明顯加快。隨著接種量的增加，啤酒酵母103對低聚糖的消耗量加大，蔗糖的降解已不能滿足啤酒酵母103生長的需要，此時棉籽糖和水蘇糖的降解必將加快。因此，確定最佳接種量為3%。
2.3最佳工藝參數(shù)的確定
由單因素試驗可以看出在發(fā)酵過程中，pH、接種量和糖液濃度對反應(yīng)的影響較大，同時通過對大豆糖蜜的低聚糖含量進(jìn)行分析，其中水蘇糖含量相對較高。因此，確定在pH為5、接種量為3%、糖液濃度為4%的基礎(chǔ)上采用中心組合設(shè)計(Box-Behnken)響應(yīng)面分析方法，以pH (A)、接種量(B)和糖液濃度(C)為自變量，發(fā)酵液中蔗糖的保留率（R1）和水蘇糖的保留率( R2)為響應(yīng)值設(shè)計響應(yīng)面試驗。自變量水平編碼表和試驗設(shè)計方案及結(jié)果見表3和表4。
通過多元回歸擬合，得到R1和R2對A、B、C的回歸方程為：
R1=10.5 8-0.21A-2.79B+4.23C+0.28AB-0.75AC-1.85BC+4.10A2+6.70B2+8.07C2
R2=92.10+1.44A+2.35 B+0.71C+2.42AB+0.70AC+0.62BC-5.25A2-4.23B2-3.20C2
采用Design Expert 8.0.6軟件對發(fā)酵后蔗糖保留率的試驗結(jié)果進(jìn)行方差分析，分析結(jié)果如表5所示。
由表5可知，方程因變量和自變量之間的線性關(guān)系顯著，該模型回歸極顯( p≤0.000 1)，失擬項為0.665 2不顯著(p>0.05)，且該模型R2=98.13%，
=95.73%，表明此模型與試驗擬合良好，可較好地反映各因素與蔗糖保留率之間的影響關(guān)系。通過F值檢驗判斷回歸方程中各個變量的顯著性情況。概率p（F>F a）值越小，說明相應(yīng)變量越顯著。方程中一次項C達(dá)到了極顯著( p<0.001)的水平，B和C的交互作用對蔗糖保留率的影響顯著(p<0.05)，A和C、A和B的交互作用對蔗糖保留率的影響不顯著(p>0.05)。
根據(jù)擬合的二次多項回歸方程圖6分別給出了pH、接種量和糖液濃度的交互作用對蔗糖保留率的響應(yīng)曲面圖。
采用Design Expert 8.0.6軟件對發(fā)酵后水蘇糖保留率的試驗結(jié)果進(jìn)行方差分析，分析結(jié)果如表6所示。
由表6可知，方程因變量和自變量之間的線性關(guān)系顯著，該模型回歸極顯( p≤0.000 1)，失擬項為0.058 5不顯著(p>0.05)，且該模型R2=97.64%，
=94.60%，表明此模型與試驗擬合良好，可較好地反映各因素與水蘇糖保留率之間的影響關(guān)系。通過F值檢驗判斷回歸方程中各個變量的顯著性情況。概率p（F>F a）值越小，說明相應(yīng)變量越顯著。A和B的
交互作用對水蘇糖保留率的影響顯著(p<0.05)，A和C、B和C的交互作用對水蘇糖保留率的影響均不顯著(p>0.05)。
根據(jù)擬合的二次多項回歸方程，圖7分別給出了pH、接種量和糖液濃度的交互作用對水蘇糖保留率的響應(yīng)曲面圖。
利用響應(yīng)面優(yōu)化分析方法對回歸模型進(jìn)行分析，尋找最優(yōu)相應(yīng)，結(jié)果見表7。為檢測響應(yīng)面方法所得結(jié)果的可靠性，按照表中的整理值進(jìn)行試驗，同時對棉籽糖保留率進(jìn)行測定，得到的蔗糖保留率為10.3%，水蘇糖保留率為92.5%，，棉籽糖保留率為81.0%。預(yù)測值與試驗值之間的良好擬合性證實了模型的有效性，表明所得出的回歸方程可以很好地反應(yīng)pH、接種量、糖液濃度與蔗糖保留率、水蘇糖保留率的關(guān)系。
3結(jié)論
通過試驗數(shù)據(jù)的比較，選擇了對蔗糖有高消耗率和功能性高保留率的啤酒酵母103作為發(fā)酵菌種，通過研究酵母發(fā)酵試驗中pH、溫度、時間、糖蜜濃度和接種量對發(fā)酵效果的影響，最終確定的最佳發(fā)酵工藝為：pH 5.0、溫度33℃、時間11 h、糖蜜濃度4%、接種量3.1%。發(fā)酵前后大豆糖蜜中的低聚糖，有著明顯的變化，蔗糖去除率達(dá)到90%左右，棉籽糖和水蘇糖的保存率分別為81.0%和92.5%。較發(fā)酵前功能性成分提高50%以上，大大提高了工作效率。試驗通過發(fā)酵法提純功能性低聚糖，對大豆糖蜜進(jìn)行了較充分的利用，為后期的分離奠定基礎(chǔ)。
