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作者：張毅   

  使用丁醇沉淀法分離直鏈淀粉和支鏈淀粉，人們已經(jīng)進(jìn)行了有關(guān)研究。曾凡逵，李彬，吳平等分別對(duì)馬鈴薯淀粉、玉米淀粉、錐栗淀粉采用該方法進(jìn)行了直鏈、支鏈淀粉的分離，結(jié)果顯示效果都比較好。對(duì)直鏈、支鏈淀粉分離次數(shù)及效果的研究并不多，因此著重進(jìn)行分析討論，以促進(jìn)我國(guó)直鏈、支鏈淀粉的深入研究以及淀粉工業(yè)的蓬勃發(fā)展。同時(shí)為后續(xù)“直鏈淀粉含量抗性淀粉得率的影響”試驗(yàn)做前期準(zhǔn)備。

1  材料與方法

1.1材料與試劑

  小麥淀粉：陜西大河粉業(yè)有限公司；標(biāo)準(zhǔn)直鏈淀粉、標(biāo)準(zhǔn)支鏈淀粉：美國(guó)Sigma公司；氫氧化鈉（分析純）、氫氧化鉀（分析純）：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；鹽酸（分析純）、無(wú)水乙醇（分析純）、正丁醇（分析純）、異戊醇（分析純）：天津市天力化學(xué)試劑有限公司；碘化鉀（分析純）、碘（分析純）：天津市東麗區(qū)天大化學(xué)試劑廠。

1.2主要儀器與設(shè)備

  UV-2600紫外分光光度計(jì)：尤尼柯（上海）儀器有限公司；SC-3610離心機(jī)：安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；DZF真空干燥箱：北京科偉永興儀器有限公司；電子天平BS 324S萬(wàn)分：賽多利斯儀器有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀RE 52A:上海亞榮升華儀器廠。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1小麥原淀粉水分含量測(cè)定

  采用GB 5009.3-2010中的直接干燥法，精密稱量后，置101℃～105℃ 干燥箱中，瓶蓋斜支于瓶邊，干燥2～4 h后，蓋好取出，放入干燥器內(nèi)冷卻0.5 h后稱量。然后再放入101℃～105℃干燥箱中干燥1h左右，取出，放入干燥器內(nèi)冷卻0.5 h后再稱量。并重復(fù)以上操作至前后兩次質(zhì)量差不超過(guò)2 mg，即為恒重。

  試樣中的水分的含量按式(1）進(jìn)行計(jì)算。

  X  =(m1-m2)／(m3-m4)×100%  (1)

  式中：X-----試樣中水分的含量，g/100 g；m1——稱量瓶（加海砂、玻棒）和試樣的質(zhì)量，g；m2——稱量瓶（加海砂、玻棒）和試樣干燥后的質(zhì)量，g；m3——稱量瓶（加海砂、玻棒）的質(zhì)量，g；m4——稱量瓶（加海砂、玻棒）干燥后的質(zhì)量，g。

  水分含量≥1 g/100 g時(shí)，計(jì)算結(jié)果保留三位有效數(shù)字；水分含量<1 g/100 g時(shí)，結(jié)果保留兩位有效數(shù)字：

1.3.2原淀粉中直鏈淀粉與支鏈淀粉的比例的確定

  早期的測(cè)定多采用單波長(zhǎng)法，事實(shí)上單波長(zhǎng)法測(cè)定的是直鏈淀粉，因?yàn)橹挥兄辨湹矸叟c碘形成藍(lán)色，而支鏈淀粉與碘的結(jié)合能力很弱，而且顏色呈紫紅色。因?yàn)橹�、支鏈淀�?碘復(fù)合物的吸收峰重疊，因此不能消除樣品溶液中同時(shí)存在的支鏈淀粉與碘形成的紫紅色復(fù)合物及其他背景的吸收。雙波長(zhǎng)法可以同時(shí)測(cè)定直、支鏈淀粉的含量，進(jìn)而計(jì)算總淀粉含量。

1.3.2.1淀粉標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

  稱取50.0 mg標(biāo)準(zhǔn)直鏈淀粉，放入100 m L容量瓶中，加入1 mol/L NaOH溶液5 m L，在熱水中溶解后，取出，用蒸餾水定容至100 m L，混勻，即為0.5 mg/m L直鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)溶液。取標(biāo)準(zhǔn)溶液0，0.1，0.3，0.5，0.7，0.9，1.1和1.3 m L分別置于25 m L比色管中，加15m L H2O以0.1 mol/L HC1調(diào)pH至3.5，加0.5 m碘試劑，定容，混勻，即得濃度為0，2，6，10，14，18，22和26 μg

/m L的直鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)溶液系列。

  同樣方法制備支鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)溶液，考慮實(shí)際樣品中支鏈淀粉的含量較高，因此配制標(biāo)準(zhǔn)溶液系列對(duì)分別取0.5 mg/m L支鏈淀粉溶液0，1，2，3，4和5m L，得到0，20，40，60，80和100 μg

/m L的標(biāo)準(zhǔn)溶液系列。

1.3.2.2確定測(cè)定波長(zhǎng)與參比波長(zhǎng)

  各選一適宜濃度的直鏈淀粉（20 μg/m L）和支鏈淀粉（60 μg/m L）標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別在紫外一可見(jiàn)分光光度計(jì)上進(jìn)行400～900 nm光譜掃描，將吸收曲線疊加繪制在同一個(gè)坐標(biāo)系中。最大吸收波長(zhǎng)為各自的測(cè)定波長(zhǎng)；通過(guò)作圖法分別得到各自的參比波長(zhǎng)。

1.3.2.3雙波長(zhǎng)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

  將所配制的直鏈淀粉系列標(biāo)準(zhǔn)溶液分別在測(cè)定波長(zhǎng)和參比波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以蒸餾水作空白，以濃度C為橫坐標(biāo)，以吸光度差值為縱坐標(biāo)作直鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算回歸方程。

  同法做出支鏈淀粉的標(biāo)準(zhǔn)曲線和回歸方程。

1.3.2.4含量計(jì)算

  根據(jù)所得直鏈淀粉與支鏈淀粉雙波長(zhǎng)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算原淀粉中直鏈淀粉與支鏈淀粉比例。

1.3.3直鏈淀粉與支鏈淀粉的分離與純化

1．3.3．直鏈淀粉與支鏈淀粉的粗分離

  準(zhǔn)確稱取10 g干燥后的小麥淀粉，加入少量無(wú)水乙醇分散并濕潤(rùn)樣品，再加入350 m L 0.5 mol/L的氫氧化鈉，在沸水浴中攪拌20 min，使溶液清澈透明，無(wú)結(jié)團(tuán)狀，冷卻后離心3 500 r/min 20 min，用2rnol/L的鹽酸中和至中性，加入100 m L正丁醇-異戊醇(3：1)混合液，在沸水浴中加熱攪拌10 min后，冷卻至室溫，于2℃~4℃的冰箱中靜置48 h，取出，離心3 500 r/min 20 min，得到的沉淀物為粗直鏈淀粉，離心液為粗支鏈淀粉。

1.3.3.2直鏈淀粉的純化

  將粗直鏈淀粉沉淀全部移人正丁醇飽和的200 m L水中，加熱溶解至溶液透明，冷卻至室溫后放入2℃~4℃的冰箱中靜置24 h，取出離心3 500 r/min，20min，將所得沉淀物按上述步驟重復(fù)操作10次（即重結(jié)晶10次），將沉淀物用無(wú)水乙醇洗滌數(shù)次后，真空干燥，即得純化的直鏈淀粉樣品。

  每次純化后取樣少許，洗滌干燥后置于干燥器，便于之后測(cè)定每次純化后的含量。

1.3.3.3支鏈淀粉的純化

  將2.2.1中的粗支鏈淀粉上清液置于分液漏斗中靜置，取下層加入40 m L正丁醇-異戊醇(3：1)混合液，在沸水浴中加熱攪拌至溶液分散透明，冷卻至室溫，移人2℃～4℃冰箱中靜置48 h，離心3 500 r/min，20 min去除沉淀，用上清液重復(fù)上述操作10次（即重結(jié)晶10次）。將最終上清液加入2倍體積的無(wú)水乙醇沉淀，低溫靜置24 h后離心，將沉淀溶于熱的200 m L0.5 mol/L的NaOH溶液中，離心去沉淀，中和。離心液中再加2倍體積的無(wú)水乙醇，將沉淀溶于200 m L蒸餾水中，用2倍體積的無(wú)水乙醇再沉淀，以無(wú)水乙醇洗滌數(shù)次，真空干燥得到純化的支鏈淀粉樣品。

  同樣每次純化后取樣，洗滌干燥后置于干燥器。

1.3.4分離后，直鏈、支鏈淀粉藍(lán)值的測(cè)定

  藍(lán)值是表示淀粉結(jié)合碘能力的一個(gè)指標(biāo)，直鏈淀粉由于其線性聚合度很高，6個(gè)葡萄糖分子就可以結(jié)合1個(gè)碘，藍(lán)值很大，一般為0.8～1.2。支鏈淀粉的側(cè)鏈鏈長(zhǎng)只有14～30葡萄糖殘基，與碘結(jié)合能力很弱，故藍(lán)值較小，在0.08～0.22。測(cè)定方法采用Gibert和Spragg法。然后按式(2)計(jì)算：

  藍(lán)值=A680×4／樣品的濃度(mg/d L)  (2)

1.3.5直鏈、支鏈淀粉含量測(cè)定

1.3.5.1標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

  將2.2中所配制的直鏈、支鏈淀粉系列標(biāo)準(zhǔn)溶液分別在各自最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以濃度C為橫坐標(biāo)，以吸光度A為縱坐標(biāo)，分別得到直鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)曲線與支鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算回歸方程。

1.3.5.2含量計(jì)算

  根據(jù)所得直鏈淀粉與支鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算每次純化后取樣的直鏈淀粉與支鏈淀粉含量。

2結(jié)果與分析

2.1原淀粉含水量

  經(jīng)直接干燥法，測(cè)得原淀粉含水量為13.2%。

2.2原淀粉中直鏈淀粉與支鏈淀粉比例

  圖1為直鏈、支鏈淀粉分別于碘結(jié)合后的顏色，圖2為直鏈淀粉(20 μg/L)和支鏈淀粉(60μg /m L)標(biāo)準(zhǔn)溶液碘吸收光譜掃描圖�？梢�(jiàn)小麥直鏈淀粉-碘與支鏈淀粉-碘吸收曲線存在明顯的差異，說(shuō)明二者與碘結(jié)合能力、結(jié)構(gòu)存在較大差異。用作圖法（圖中虛線所示），可以得到直鏈淀粉與支鏈淀粉最大吸收波長(zhǎng)分別為635和533 nm，參比波長(zhǎng)分別為740和668 nm。

  圖3顯示，直鏈、支鏈淀粉的雙波長(zhǎng)標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好。經(jīng)計(jì)算，得出小麥原淀粉中：直鏈淀粉含量為27.74%，支鏈淀粉含量為71.15%，原淀粉純度為98.89%。

2.3鏈淀粉、支鏈淀粉分離過(guò)程

  直鏈淀粉與支鏈淀粉各經(jīng)過(guò)10次純化干燥后，得到純化直鏈淀粉與支鏈淀粉拍攝照片見(jiàn)圖4。

  從圖4可以看出，制得的小麥直鏈淀粉經(jīng)干燥后，邊緣不規(guī)則，呈棉絮形。支鏈淀粉經(jīng)干燥后，呈蠟質(zhì)狀。

  最終得到直鏈淀粉和支鏈淀粉分別為1.98 g和4.24 g，二者得率分別為19.8%和42.4%(原料為10.00g)。直鏈淀粉和支鏈淀粉的損失主要來(lái)自于進(jìn)一步分離直鏈淀粉中的支鏈淀粉，和支鏈淀粉中的直鏈淀粉，另外與分離次數(shù)也有一定關(guān)系。并且可以看出在分離過(guò)程中，支鏈淀粉損失更大。

2.4藍(lán)值

  測(cè)得最終分離得到的小麥直鏈淀粉和支鏈淀粉的藍(lán)值為分別為1.08和0.15，均處于相應(yīng)的分布范圍內(nèi)，表明純化后的小麥直鏈淀粉和支鏈淀粉的純度較高。

2.5直鏈淀粉與支鏈淀粉含量測(cè)定

  圖5為直鏈淀粉最大吸收波長(zhǎng)( 635 nm)處作出的標(biāo)準(zhǔn)曲線，據(jù)此測(cè)得直鏈淀粉每次純化后其含量，如圖6所示。可以看出直鏈淀粉純化中，5次純化之后其含量趨于平緩，7次純化后純度可以達(dá)到98.21%。

  圖7為支鏈淀粉最大吸收波長(zhǎng)( 533 nm)處作出的標(biāo)準(zhǔn)曲線，據(jù)此測(cè)得支鏈淀粉每次純化后其含量，如圖8所示。可以看出支鏈淀粉純化中，6次純化之后其含量趨于平緩，10次純化后純度可以達(dá)到98.25%。

3結(jié)論

  1)小麥原淀粉中，直鏈淀粉含量為27.74%，支鏈淀粉含量為71.15%。

  2)得到直鏈淀粉和支鏈淀粉的藍(lán)值為1.08和0.15，二者得率分別為19.8%和42.4%。

  3)直鏈、支鏈淀粉在分離第6次之后效果趨于平緩，分離7次、10次后，純度可以達(dá)到98%。

4)實(shí)驗(yàn)室中用丁醇沉淀法，在離心轉(zhuǎn)速為3 500r/min，離心時(shí)間20 min的分離條件下，可以得到純度很高的直鏈淀粉和支鏈淀粉。

4摘要  采用正丁醇反復(fù)沉淀法，對(duì)小麥淀粉中的直鏈淀粉和支鏈淀粉進(jìn)行多次反復(fù)離心純化，實(shí)現(xiàn)二者的分離。通過(guò)雙波長(zhǎng)法，測(cè)定了原淀粉中直鏈和支鏈淀粉的比例。測(cè)定了最終得到的直鏈和支鏈淀粉的藍(lán)值，結(jié)果均在標(biāo)準(zhǔn)范圍內(nèi)。重點(diǎn)測(cè)定了分離次數(shù)與純度的關(guān)系，分離次數(shù)分別達(dá)到7次、10次后，直鏈和支鏈淀粉的純度可以達(dá)到98%。結(jié)果顯示，該方法用于實(shí)驗(yàn)室分離小麥直鏈淀粉與支鏈淀粉效果顯著。