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趙銀平  趙曉祥  楊偉  王玥

（東華大學環(huán)境科學與T程學院，上海201620）

  摘要：通過研究6種外加碳源對菌株GH10降解BDE-209產(chǎn)生的影響，證明葡萄糖是菌GH10降解BDE-209的最佳外加碳源，降解培養(yǎng)基中葡萄糖的最適濃度為2 mg/L。經(jīng)過5d的降解培養(yǎng)，在第3天時培養(yǎng)基中BDE-209的殘余濃度最低，其濃度從10 mg/L降為1.24 mg/L;與不添加葡萄糖的試驗相比，BDE-209的降解率從42.24%提高到87.61u/0；菌株GH10對BDE-209的降解符合一級反應(yīng)動力學，降解動力學方程為C=12.064e-0.67U，半衰期為1.03 d，說明添加葡萄糖能夠有效促進菌GH10降解BDE-209。

  關(guān)鍵詞：菌株GH10；BDE-209；降解率；外加碳源；葡萄糖

  多溴聯(lián)苯醚( polybrominated  diphenyl  ethers，PBDEs)作為一類高效添加型溴系阻燃劑，被廣泛應(yīng)用于各種電子、電器、紡織、建材、塑料等產(chǎn)品中。此類產(chǎn)品在大量生產(chǎn)、使用和廢棄的過程中，均不同程度的造成PBDEs進入各種環(huán)境介質(zhì)中，如水體、大氣、沉積物及污泥、鳥類、人體血液、母乳等。據(jù)研究表明，PBDEs可引起生物體的神經(jīng)毒性、內(nèi)分泌干擾毒性等，甚至還具有致癌性，因此環(huán)境中的PBDEs嚴重威脅人類健康及生態(tài)安全。

  多溴聯(lián)苯醚中的五溴聯(lián)苯醚和八溴聯(lián)苯醚已被世界所禁用，而十溴聯(lián)苯醚（BDE-209）還在使用中，這就引起人們對BDE-209的高度關(guān)注。BDE-209具有溴化程度高，阻燃性能好，價格低等優(yōu)點，是目前使用最多的一種阻燃劑，因此環(huán)境中BDE-209的含量也在呈增加趨勢。PBDEs的溴化程度越高，分子越穩(wěn)定，并且BDE-209的分子結(jié)構(gòu)對稱，所以BDE-209是最穩(wěn)定的PBDEs。同時BDE-209具有低揮發(fā)性、環(huán)境穩(wěn)定性、脂溶性等特點，能夠?qū)ι�物體產(chǎn)生各種毒性，所以環(huán)境中BDE-209的降解已成為環(huán)境科學研究的熱點。目前，BDE-209的降解方法主要有光降解法、零價鐵法及生物法等，光降解過程會產(chǎn)生多溴二苯并二噁英及多溴二苯并呋喃，造成二次污染，并且成本較高，不適宜工程應(yīng)用；零價鐵降解過程會出現(xiàn)鐵屑結(jié)塊、溝流等現(xiàn)象，降低處理效果；生物法投資少、降解過程不會對環(huán)境產(chǎn)生二次污染，被認為是最有前景的降解方法。該研究采用微生物法對BDE-209進行降解，以本課題組篩選的降解高濃度BDE-209的長野雷夫松氏菌GH10作為實驗菌種，采用固相萃取法和高效液相色譜法提取和測定降解體系中的BDE_209，研究外加碳源對菌株GH10降解BDE-209產(chǎn)生的影響，為環(huán)境中BDE-209的降解提供一定的理論依據(jù)及實驗基礎(chǔ)。

1實驗部分

1.1實驗材料

1.1.1培養(yǎng)基

  (1)LB液體培養(yǎng)基：魚粉蛋白胨，10 g；酵母粉，5 g；氯化鈉，5 g；去離子水，1 000 mL；pH=7.0。向LB液體培養(yǎng)基中加入2%的瓊脂即可得到LB固體培養(yǎng)基。

  (2)無機鹽培養(yǎng)基(MSM):KH2P04，2.65 g;Na2HP04，4.26 g;MgS04 - 7H20,0.2 g;CaCl2 -2H20,0.02 g;FeS04'7H20，0.014 g；NH4C1，0.5 g；微量元素，l mL;去離子水，1 000 mL;pH=7.0。其中微量元素溶液組成為：FeS04 - 7H20,2.1 g;ZnCl2,0.07 g;CuS04 - 5H20,0.03 g;MnS04 -H20,0.06 g;CoCl2．6H20,0.19 g;(NH4)6M07024.4H20，0.024 g；去離子水，1000 mL。

  無機鹽降解培養(yǎng)基：向無機鹽培養(yǎng)基中加入一定量的濃度為1 000 mg/L的BDE-209-=甲基亞砜標準儲備液，使得降解體系中BDE-209的濃度為10 mg/L。

  外加碳源無機鹽降解培養(yǎng)基：向無機鹽降解培養(yǎng)基中分別加入6種不同的外加碳源，控制外加碳源的濃度為5 mg/L，6種外加碳源分別是葡萄糖、麥芽糖、淀粉、魚粉蛋白胨、酵母粉、牛肉膏，添加外加碳源的試驗組分別命名為試驗組1、試驗組2、試驗組3、試驗組4、試驗組5、試驗組6。

1.1.2菌株來源

  實驗中所用的長野雷夫松氏菌（Leifsoniashin -shuensis GH10，簡稱GH10）系本課題組篩選獲得的能夠降解高濃度BDE-209的菌株，其最適生長條件為30℃，pH=7.0，搖床轉(zhuǎn)速150 r/min。

1.2試驗方法

1.2.1菌種的活化及菌懸液的制備

  取1環(huán)保藏于甘油中的菌GH10直接在LB固體培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)3d，然后挑取單菌落再一次劃線培養(yǎng)3d，一共活化2次。最后挑取單菌落于LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h，此時菌GH10處于對數(shù)期，然后取適量菌液于6 000 r/min離心6min，收集菌體并用生理鹽水洗滌菌體3次，以等體積的生理鹽水重懸，即得菌懸液。

1.2.2  菌GH10對BDE-209的降解

  于250 mL錐形瓶中，加入無機鹽降解培養(yǎng)基、外加碳源無機鹽降解培養(yǎng)基45 mL，121℃高壓滅菌25min。待培養(yǎng)基冷卻到室溫接入GH10菌懸液，接種量為10%。30℃，150 r/min搖床避光降解培養(yǎng)5d，每天各取樣1次（取樣前充分搖勻），每次取樣2 mL，用2x2 mL二氯甲烷／正己烷（V/V=l：1）對培養(yǎng)基中殘余的BDE-209進行洗脫，合并洗脫液后立即進行HPLC檢測。以接人滅活的菌懸液的無機鹽培養(yǎng)基為空白對照實驗，每一處理設(shè)3個平行，重復(fù)2次。進行菌株GH10對BDE-209的降解動力學研究時，每0.5 d取樣1次，共取樣3d。

1.2.3  固相萃取法

  采用固相萃取法提取降解體系中的BDE-209，固相萃取儀：TSBEQ-CR1012，上海anpel科學儀器有限公司；固相萃取小柱C-18柱：HC-C18，200 mg/3 mL，上海anpel科學儀器有限公司。BDE-209的固相萃取過程為：先用2 mL二氯甲烷預(yù)洗C-18固相萃取小柱，于負壓下抽干溶劑，再依次用3 mL甲醇和3 mL超純水活化，活化過程要始終保持小柱床體濕潤；然后將2 mL樣品進行上樣，之后用3 mL超純水淋洗以去除吸附在床體上的雜質(zhì)，并于負壓下抽真空，直至C-18小柱床體完全干燥；最后用4 mL(2 mLx2)正己烷/二氯甲烷( V/V=l:l)對BDE-209進行洗脫，收集洗脫液。最終洗脫液過無水硫酸鈉除水，之后經(jīng)0.22 um有機濾膜過濾后進行檢測。此法BDE-209的回收率為99.61%，相對標準偏差為2.84%。

1.2.4高效液相色譜法

  采用高效液相色譜法（HPLC法）測定降解體系中BDE-209的濃度，其檢測條件為：高效液相色譜儀：LC-20AT．日本島津公司；色譜柱：Inertsil ODS-3 C18(5um，250 mmx4.6 mm);檢測波長：260 nm；柱溫：30℃；流動相：V(乙腈)/V(水)=95：5，進行HPLC檢測前應(yīng)超聲30 min以上以除去氣泡；流速：1.2 mL/min；進樣量：20 uL；進樣方式：手動進樣。此條件下BDE-209的出峰時間為24.57 min，采用HPLC法分別測定濃度為0、2、4、6、8、10、12、14 mg/L的BDE -209溶液，將測得的各濃度溶液相對應(yīng)的峰面積(y)隨BDE-209濃度(x)作圖，建立BDE-209標準曲線，該標準曲線方程為y=16 578x-1 973.5，線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 4。

1.2.5傅里葉紅外光譜法

  采用傅里葉紅外光譜法( FTIR)對BDE-209降解體系中基團的變化情況進行分析，檢測條件為：分辨率為2 cm；波數(shù)范圍為4 000～400 cm；溴化鉀中萃取樣品含量為20 uL，待溶劑揮發(fā)盡后進行檢測。

2結(jié)果與討論

2.1  無外加碳源時茵GH10對BDE-209的降解

經(jīng)過5d的降解，菌株GH10在無機鹽降解培養(yǎng)基中對BDE-209的降解效果見圖1和圖2。從圖1中可看出試驗的前3d，培養(yǎng)基中的BDE-209被菌株GH10快速降解消耗，由于該菌株是專門篩選的以BDE-209為唯一碳源進行生長和繁殖的微生物，所以經(jīng)過很短暫的適應(yīng)期后菌株GH10開始快速降解培養(yǎng)基中的BDE-209，在第3天時培養(yǎng)液中BDE-209的濃度最低，為5.78 mg/L，此時BDE-209的降解率達到最高，為42.24%(見圖2)；第4天和第5天，培養(yǎng)液中的BDE-209的濃度略微升高，此時菌株GH10開始進入衰亡期，死亡率大于生長率，導(dǎo)致死亡的菌株GH10體內(nèi)未被吸收分解的BDE-209釋放到培養(yǎng)液中，從而導(dǎo)致培養(yǎng)液中BDE-209的濃度升高。

2.2  添加外加碳源時茵GH10對BDE-209的降解

無機鹽降解培養(yǎng)基中添加6種外加碳源后菌株GH10對BDE-209的降解效果見圖3。從圖3中可看出，經(jīng)過5d的降解培養(yǎng)，試驗組1和試驗組2中BDE-209的降解率均明顯高于不添加外加碳源的試驗組，試驗組1和試驗組2中BDE-209的濃度見圖4。試驗組1與不添加外加碳源的試驗組降解情況一致，均在第3天時BDE-209的降解率達到最大，其降解率為60.12%，遠高于不添加外加碳源的試驗組的降解率(42.24%)，說明葡萄糖能夠促進菌株GH10對BDE-209的降解，原因可能是菌株GH10在消耗葡萄糖時產(chǎn)生的酶能夠促進自身對BDE-209的降解；試驗組2在第4天時BDE-209的降解率達到最大，其降解率為51.37%，麥芽糖也能夠促進菌株GH10對BDE-209的降解，但降解速率小于添加葡萄糖的試驗組；添加其余4種外加碳源的試驗組，在第5天時BDE-209的降解率達到最大，但BDE-209的降解率均小于添加葡萄糖和麥芽糖的試驗組的降解率，略高于不添加外加碳源的試驗組的降解率。

  在試驗的第1天，添加6種外加碳源的試驗組的BDE-209的降解率均小于不添加外加碳源的試驗組，原因可能是菌株GH10優(yōu)先利用外加碳源進行自身的生長和繁殖，只有少量的BDE-209被菌株GH10消耗降解；在試驗組1，菌株GH10從第2天開始快速消耗降解BDE-209；在試驗組2，菌株GH10從第3天開始快速消耗降解BDE-209，而添加其他4種外加碳源的試驗組菌株GH10從第4天才開始消耗降解BDE-209，因為淀粉、酵母粉、魚粉蛋白胨、牛肉膏均屬于大分子物質(zhì)，微生物在利用這些物質(zhì)時，首先將大分子物質(zhì)分解成小分子后才進行消耗利用，并且大分子物質(zhì)相比于小分子物質(zhì)能夠為菌株GH10提供足夠的的營養(yǎng)，因此在添加淀粉、酵母粉、魚粉蛋白胨、牛肉膏等大分子物質(zhì)的試驗組里，菌株GH10優(yōu)先利用外加碳源進行自身的生長和繁殖，在試驗的前3d里，外加碳源能夠為菌株GH10提供充足的營養(yǎng)，導(dǎo)致BDE-209的降解率較低，從第4天開始菌株GH10才開始快速消耗BDE-209。

  葡萄糖和麥芽糖是較好的外加碳源，能夠有效促進菌株GH10對BDE-209的降解，其它外加碳源的促進效果不明顯；添加葡萄糖時，菌株GH10能夠高效降解BDE-209，并且在第3天時降解率達到最大，而添加其它外加碳源時，降解率達到最大時的時間要長于3d，因此葡萄糖是菌株GH10降解BDE-209的最佳外加碳源。

2.3  不同濃度的葡萄糖對菌GH10降解BDE-209的影響

向無機鹽降解培養(yǎng)基中分別添加一定量的葡萄糖，使培養(yǎng)基中葡糖糖的濃度分別為0、0.5、1、2、3、4、5、10、100、1 000 mg/L，經(jīng)過3d的降解培養(yǎng)，葡萄糖濃度為0、0.5、1、2、3、4、5、10 mg/L的試驗組中BDE-209的降解效果如圖5所示，葡萄糖濃度為100、1 000mg/L的試驗組中BDE-209基本沒有降解，高濃度的葡萄糖能夠為菌GH10提供充足的營養(yǎng)，導(dǎo)致菌株GH10完全只利用葡萄糖進行生長繁殖。從圖5中可看出，葡萄糖濃度為2 mg/L時，培養(yǎng)基中BDE-209的殘余濃度最低，其濃度為1.24 mg/L，降解率為87.61%；葡萄糖濃度<2 mg/L時，BDE-209的降解率隨著葡萄糖濃度的增加而提高；葡萄糖濃度>2 mg/L時，BDE-209的降解率隨著葡萄糖濃度的增加而降低。

  濃度為2 mg/L的葡萄糖既能夠使菌株GH10的菌體數(shù)量在短時間內(nèi)達到一定的規(guī)模，又能夠使菌株GH10在葡萄糖被耗盡后快速降解消耗BDE-209，使培養(yǎng)基中BDE-209的濃度降低；葡萄糖濃度<2 mg/L時，菌體數(shù)量不足，被菌株GH10消耗的BDE-209也較少；葡萄糖濃度>2 mg/L時，碳源比較充足，雖然菌體數(shù)量較多，但葡萄糖可以較長時間為菌株GH10提供能量使其生長繁殖，導(dǎo)致BDE-209在短時間內(nèi)不能夠被降解消耗。因此以葡萄糖作為外加碳源時，當其濃度為2 mg/L時，BDE-209的降解率最大。

2.4  菌株GH10對BDE-209的降解動力學

研究菌株GH10對BDE-209的降解動力學時，每隔12 h取樣1次并測定培養(yǎng)基中BDE-209的殘余濃度。采用Monod方程來描述BDE-209的降解效果，Monod方程的指數(shù)模型為C=Coe-'u，式中：Co為BDE-209的初始濃度，mg/L；C為BDE-209的殘留濃度，mg/L；k為BDE-209降解速率的動力學常數(shù)；f為降解培養(yǎng)時間，d。無外加碳源和添加2mg/L葡萄糖時BDE-209的降解擬合曲線如圖6、圖7所示，從圖中可看出2種條件下的擬合曲線均符合一級反應(yīng)動力學，擬合曲線方程及各個參數(shù)見表1。

從表1可看出，在無外加碳源的情況下，菌株GH10對BDE-209的降解較為緩慢，半衰期為3.98d；而添2 mg/L葡萄糖作為共代謝基質(zhì)后，BDE-209的降解速率有所提高，半衰期縮短至1.03 d。該動力學結(jié)果說明，添加外加碳源葡萄糖能夠有效促進菌株GH10對BDE-209的降解效果。

2.5  BDE-209的降解機理

BDE-209被菌株GH10降解一定時間后，降解體系中基團變化情況見圖8。3 433 cm-1處的峰來自于締合O-H的伸縮振動；1631.7 cm-1處的峰來自于-C-C-的伸縮振動，根據(jù)BDE-209的結(jié)構(gòu)推測，此為苯環(huán)中的-C-C-引起；560.7 cm-1處的峰來自于C-Br的伸縮振動，降解后此峰有所減小，由此推測BDE-209苯環(huán)上的Br被菌株GH10降解脫除，說明BDE-209的降解過程中存在脫Br作用。Deng等的研究表明，在好氧菌株DB1的作用下也存在脫溴作用，這與本研究有相似之處。

  BDE-209的生物降解過程可能和PCBs的降解機理相似，PCBs通過間位和對位脫鹵生成低鹵代PCBs ，菌株GH10可能在BDE-209的間位和對位脫溴生成低溴代的PBDEs，但是PCBs的生物降解過程涉及到PCBs的開環(huán)，而完全溴化的BDE-209很難被直接開環(huán)，因此BDE-209的生物降解機理最有可能是通過脫溴作用形成低溴代聯(lián)苯醚，然后開環(huán)被進一步降解。

3結(jié)論

  通過研究菌株GH10對BDE-209的降解，表明BDE-209通過脫溴而被降解，并且6種外加碳源對菌株GH10降解BDE-209產(chǎn)生一定影響，結(jié)果表明葡萄糖能夠最為有效促進菌株GH10對BDE-209的降解，培養(yǎng)基中葡萄糖的最適濃度為2 mg/L。在此條件下，經(jīng)過5d的降解培養(yǎng)，在第3天時培養(yǎng)基中BDE-209的殘余濃度最低，濃度為1.24 mg/L，與不添加外加碳源的試驗相比BDE-209的降解率從42.24%提高到87.61%；菌株GH10對BDE-209的降解符合一級反應(yīng)動力學，降解動力學方程為C=12.064e-0'670r，半衰期為1.03 d。