PCR-DGGE技術(shù)應(yīng)用于肉制品屬性鑒別研究
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何永盛，林霖，賴心田*，洪曉明，陳國(guó)培，伍聰
深圳市計(jì)量質(zhì)量檢測(cè)研究院（深圳518109）
摘要 肉制品生物屬性的真?zhèn)螁栴}是近年來消費(fèi)者關(guān)注的熱點(diǎn)問題，為鑒定市售肉制品的屬性真?zhèn)危⒁环N基于PCR-DCJCJE技術(shù)的肉制品屬性鑒別方法。以文獻(xiàn)報(bào)道的Barcoding引物建立鑒別肉制品屬性的PCR-DCJGE檢測(cè)方法，對(duì)實(shí)際樣品進(jìn)行檢測(cè)，將檢測(cè)結(jié)果與現(xiàn)行檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行比對(duì)。結(jié)果表明，所建立的PCR-DGGE檢測(cè)方法能有效鑒別肉制品中多種常見的動(dòng)物DNA成分，且能應(yīng)用于實(shí)際樣品檢測(cè)，可作為現(xiàn)有的動(dòng)物源性成分檢測(cè)方法的有效補(bǔ)充。
關(guān)鍵詞 PCR-DGGE;肉制品；動(dòng)物DNA成分
肉制品是人們?nèi)粘Ｉ钪胁豢苫蛉钡南M(fèi)品。伴隨著我國(guó)食品工業(yè)的飛速發(fā)展，越來越多肉制品出現(xiàn)在流通市場(chǎng)上，極大地豐富了消費(fèi)者的選擇。然而，肉制品摻偽造假是食品工業(yè)中存在已久而且不容忽視的一個(gè)問題。隨著歐洲馬肉風(fēng)波事件以及國(guó)內(nèi)多起牛羊肉制品造假事件的相繼曝光，肉制品生物屬性的真?zhèn)螁栴}也引起了消費(fèi)者的高度關(guān)注。肉制品的摻偽造假不僅直接損害了消費(fèi)者的經(jīng)濟(jì)利益，而且極有可能因?yàn)槟承┻^敏原的引入而危害消費(fèi)者健康…。因此我國(guó)出臺(tái)了多項(xiàng)檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)其進(jìn)行規(guī)范和監(jiān)管，眾多的學(xué)者也針對(duì)不同的動(dòng)物源性成分開展了相應(yīng)的普通PCR和實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法的研究。然而，基于PCR技術(shù)建立的檢測(cè)方法在每個(gè)反應(yīng)中往往只能檢測(cè)一種動(dòng)物DNA成分，如需檢測(cè)肉制品是否含有多種動(dòng)物DNA成分，則需相應(yīng)地配制多個(gè)反應(yīng)體系，或者在同一反應(yīng)體系中加人多對(duì)引物或探針進(jìn)行多重PCR檢測(cè)，在操作上較為繁瑣，而且這些方法難以應(yīng)用于含有未知屬性成分肉制品的檢測(cè)。
變性梯度凝膠電泳( Denaturing gradient gelelectrophoresis, DGGE)是由Fisher和Lerman于20世紀(jì)80年代初期發(fā)明的，用于檢測(cè)DNA突變的技術(shù)，可有效地檢測(cè)50～500 bp DNA片段內(nèi)小至單一堿基的突變。由于這一技術(shù)在揭示自然界微生物區(qū)系的遺傳多樣性和種群差異方面具有獨(dú)特的優(yōu)越性，現(xiàn)已被廣泛地應(yīng)用于米酒釀造、蔬菜發(fā)酵、肉制品加工等多個(gè)領(lǐng)
域的微生物群落結(jié)構(gòu)分析與鑒定。近年來，也有學(xué)者開始將DGGE技術(shù)應(yīng)用于微生物鑒定以外的其他領(lǐng)域，如動(dòng)物線粒體Cytb基因片段的遺傳多樣性分析以及肉類品種的鑒別等，但該領(lǐng)域的相關(guān)研究在國(guó)內(nèi)外還并不多見，且前人的研究成果仍有需要完善之處，例如在利用PCR-DGGE技術(shù)鑒別肉類品種時(shí)鴨肉和羊肉的區(qū)分并不明顯，而以鴨肉冒充羊肉是肉類造假較為常見的方式，以此作為檢驗(yàn)方法容易造成結(jié)果的誤判。旨在利用PCR-DGGE技術(shù)建立一種可以快速鑒別肉制品中常見動(dòng)物DNA成分的檢測(cè)方法，從而作為現(xiàn)有檢測(cè)方法的有效補(bǔ)充。
1 材料與方法
1.1材料與儀器
豬肉、牛肉、羊肉、雞肉、鴨肉、鵝肉、馬肉、驢肉、狗肉9種肉類標(biāo)準(zhǔn)品及市售肉制品樣品：均為當(dāng)?shù)厥惺邸?
Dcode通用突變檢測(cè)系統(tǒng)、PCR儀、電泳儀：美國(guó)BIO-RAD公司；核酸蛋白微量定量?jī)x：美國(guó)NanoDrop公司；小型冷凍離心機(jī)：德國(guó)Eppendorf公司；凝膠成像分析系統(tǒng)：英國(guó)UVI公司。
1.2試驗(yàn)方法
1.2.1 動(dòng)物組織DNA的提取
采用QIAGEN公司的DNeasy mericon Food Kit提取基因組DNA，詳細(xì)操作方法見說明書。提取得到的基因組DNA用核酸蛋白微量定量?jī)x測(cè)定濃度并統(tǒng)一稀釋至20 μg/m L。
1.2.2肉類標(biāo)準(zhǔn)品驗(yàn)證
為確保所購(gòu)買的9種肉類標(biāo)準(zhǔn)品的單一性和正確性，采用現(xiàn)行檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)中實(shí)時(shí)熒光PCR法對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)用標(biāo)準(zhǔn)及引物探針序列見表1。
表1 屬性鑒定用引物探針序列及標(biāo)準(zhǔn)
1.2.3 PCR-DGGE引物
以Barcoding引物為基礎(chǔ)，在其上游引物的5’端加入GC發(fā)夾，引物由上海生物工程合
成，序列見表2。
1.2.4 PCR-DGGE反應(yīng)體系及條件
PCR反應(yīng)體系總體積采用50μL ，其中MgCl2終濃度為1.5 m mol/L; d NTP終濃度各200 μmol/L;引物終濃度為0.2 μmol/L; DNA模板2μL 。反應(yīng)條件為94℃．5 min; 30個(gè)循環(huán)(94℃，50 s；60℃，50 s；72℃，50s)；72℃，5 min；4℃保溫。
1.2.5 PCR-DGGE反應(yīng)產(chǎn)物檢測(cè)
取5ILL PCR產(chǎn)物，用含0.5 μg/m L溴化乙錠的2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，電泳電壓為80 V，電泳時(shí)間為60 min，用凝膠成像系統(tǒng)觀察及照相。
1.2.6 DGGE凝膠制備及電泳
制備濃度為12%聚丙烯酰胺凝膠，其中變性劑尿素的濃度范圍為20%～80%，凝膠板面積為16 cm×10cm，厚度均為1 mm。
取PCR產(chǎn)物10μL ，與等體積的2×上樣緩沖液混合，依次加入變性梯度凝膠的各個(gè)泳道。電泳時(shí)溫度控制在60℃，電壓為120 V，電泳時(shí)間為6h。將電泳后的凝膠放人濃度為0.5μg /m L的溴化乙錠溶液中染色30 min，用凝膠成像系統(tǒng)觀察及照相。
1.2.7樣品檢測(cè)
檢測(cè)時(shí)設(shè)置肉類標(biāo)準(zhǔn)品，與樣品同時(shí)進(jìn)行PCR-DGGE檢測(cè)，以判斷樣品中所含屬性成分。同時(shí)，根據(jù)表1中相關(guān)檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)各樣品進(jìn)行9種動(dòng)物DNA成分的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)，以驗(yàn)證建立的PCR-DGGE檢測(cè)方法的準(zhǔn)確性。
2結(jié)果與分析
2.1 肉類標(biāo)準(zhǔn)品驗(yàn)證
按照表1中相關(guān)標(biāo)檢驗(yàn)準(zhǔn)規(guī)定的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法驗(yàn)證9種肉類標(biāo)準(zhǔn)品的生物屬性，結(jié)果顯示9種肉類標(biāo)準(zhǔn)品都只檢出了其應(yīng)有的單-DNA成分，可以用于后續(xù)的PCR-DGGE相關(guān)試驗(yàn)。
2.2 肉類標(biāo)準(zhǔn)品PCR-DGGE圖譜構(gòu)建
肉類標(biāo)準(zhǔn)品PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果如圖1所示。擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度大約為163 b p，片段大小與預(yù)期相符合。將各種肉類標(biāo)準(zhǔn)品DNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行變性梯度凝膠電泳，結(jié)果如圖2所示。從圖2的電泳結(jié)果可以看出，豬、牛、羊、雞、鴨、鵝、馬、驢、狗9種肉類標(biāo)準(zhǔn)品DNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物具有不同的電泳遷移率，在凝膠中形成了遷移位置不同的可以清晰區(qū)分的條帶，說明建立的PCR-DGGE檢測(cè)方法能有效鑒別不同的肉類品種，可以利用該方法進(jìn)行實(shí)際樣品的檢測(cè)。
2.3樣品檢測(cè)
在市場(chǎng)上購(gòu)買10批次預(yù)包裝肉制品，通過實(shí)時(shí)熒光PCR法及建立的PCR-DGGE方法對(duì)其屬性進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如表3所示。購(gòu)買的大部分肉制品都只檢測(cè)出其標(biāo)簽明示的屬性成分，但牛肉丸、羊肉串等肉制品檢出了其標(biāo)簽未明示的屬性成分，說明市場(chǎng)上的這些產(chǎn)品確實(shí)存在以廉價(jià)肉類冒充高價(jià)肉類的現(xiàn)象。同時(shí)，所建立的PCR-DGGE檢測(cè)方法與現(xiàn)行檢驗(yàn)
標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)結(jié)果完全一致，說明建立的PCR-DGGE方法是準(zhǔn)確可靠的。
3結(jié)論
所建立的PCR-DGGE檢測(cè)方法能夠有效地鑒別肉制品中的豬、牛、羊、雞、鴨、鵝、馬、驢和狗9種動(dòng)物DNA成分。在對(duì)市售肉制品的檢測(cè)驗(yàn)證中，通過與現(xiàn)行檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)使用的實(shí)時(shí)熒光PCR方法的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，證明所建立的PCR-DGGE檢測(cè)方法準(zhǔn)確可靠，能在一個(gè)反應(yīng)中同時(shí)完成對(duì)肉制品中多種動(dòng)物DNA成分的檢測(cè)，可以作為現(xiàn)有方法的有效補(bǔ)充應(yīng)用于日常檢測(cè)工作。
