91精品人妻互换日韩精品久久影视|又粗又大的网站激情文学制服91|亚州A∨无码片中文字慕鲁丝片区|jizz中国无码91麻豆精品福利|午夜成人AA婷婷五月天精品|素人AV在线国产高清不卡片|尤物精品视频影院91日韩|亚洲精品18国产精品闷骚

  李雨虹1，董文賓1*，付瑜1，樊成2，歐陽(yáng)凡1

  1．陜西科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院(西安710021)；2．陜西省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院（西安710048）

摘要水溶性多糖是鐵皮石斛植物中重要的組成成分，具有很好的保健功效。為了確定一種特異性、準(zhǔn)確性、可重復(fù)、靈敏性好的苯酚-硫酸法來定量分析鐵皮石斛的多糖含量。試驗(yàn)以D -葡萄糖作為標(biāo)準(zhǔn)單糖，確定490 nm處為檢測(cè)波長(zhǎng)。通過單因素和L9(34)正交試驗(yàn)獲得最優(yōu)反應(yīng)條件為：溫度30℃，6%的苯酚0.3 m L，濃硫酸4.5 m L，保溫時(shí)間25 min,試劑的添加順序：苯酚-樣品-濃硫酸。校正曲線在8.00～104.00 μg/m L范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，相關(guān)系

數(shù)為0.999 8。檢出限與定量限估算值分別為1.1μg /m L和3.33μg /mL。樣品溶液在顯色反應(yīng)后2h內(nèi)表現(xiàn)出高穩(wěn)定性。精密度和回收率分別為3.27%和96.9%,102.5%0。

關(guān)鍵詞鐵皮石斛；水溶性多糖：苯酚一硫酸法

 鐵皮石斛（Dendrobium officinale Kimura et Migo）為蘭科石斛屬多年生植物，又名黑節(jié)草，是一種名貴的中草藥。因其具有益胃生津，滋陰清熱等作用，有很高的藥用價(jià)值和保健功效，被譽(yù)為“中華九大仙草”之首。鐵皮石斛的主要生物活性成分有多糖、生物堿等，其中多糖的含量最多。經(jīng)藥理學(xué)研究表明，鐵皮石斛多糖具有抗氧化、抗衰老、增強(qiáng)機(jī)體免疫力、抗腫瘤等藥理活性。因此，準(zhǔn)確地鑒定鐵皮石斛多糖含量對(duì)研究與開發(fā)鐵皮石斛資源和質(zhì)量控制具有重要意義。

 目前，測(cè)定鐵皮石斛多糖含量的主要方法是苯酚-硫酸法和蒽酮-硫酸法。蒽酮-硫酸法測(cè)定的是所有碳水化合物的總量，不僅可測(cè)出戊糖與己糖，而且還包括寡糖類和多糖類（淀粉、纖維素等），故蒽酮-硫酸法不能準(zhǔn)確地測(cè)定多糖含量。而苯酚-硫酸法測(cè)定的是溶于水及乙醇的單糖和多糖類的總量，根據(jù)換算因子最終可得出多糖含量，誤差相對(duì)較小，故采用苯酚-硫酸法來測(cè)定鐵皮石斛多糖的含量。經(jīng)研究表明，鐵皮石斛多糖的結(jié)構(gòu)為一類O-乙酰葡萄甘露聚糖類型的多糖，由大量的葡萄糖構(gòu)成，所以試驗(yàn)采用葡萄糖作為苯酚-硫酸法的標(biāo)準(zhǔn)單糖。

 試驗(yàn)對(duì)影響多糖含量測(cè)定的5個(gè)因素（添加順序、保溫溫度、6%苯酚量、濃硫酸量和保溫時(shí)間）進(jìn)行單因素試驗(yàn)，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)得出最優(yōu)反應(yīng)條件，進(jìn)一步為研究鐵皮石斛資源和質(zhì)量控制提供理論基礎(chǔ)，并對(duì)今后開發(fā)鐵皮石斛多糖類保健食品奠定了基礎(chǔ)。

1  材料與方法

1.1儀器與試劑

  722N型可見分光光度計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限責(zé)任公司；RE-52型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；SHZ-D(Ⅲ)循環(huán)水式真空泵：鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；BS224S型萬分之一分析天平：北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；HH-2型電熱恒溫水浴鍋：北京科偉永興儀器有限公司；H1850型臺(tái)式高速離心機(jī)：湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；DZ-1BC真空干燥箱：天津泰斯特儀器有限公司。

 鐵皮石斛鮮品：陜西省秦脈生物科技有限公司；D-無水葡萄糖：分析純，天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠；苯酚、濃硫酸、無水乙醇、正丁醇、丙酮、三氯甲烷：分析純，天津市富宇精細(xì)化工有限公司。

1.2材料

1.2.1原材料的準(zhǔn)備

 取鐵皮石斛鮮品洗凈，將其切至約1cm長(zhǎng)的小莖段，先105 ℃殺青15 min后60℃烘干至恒重，將干燥后的莖段粉碎至細(xì)粉，過60目篩備用。

1.2.2鐵皮石斛多糖的提取

 精密稱取鐵皮石斛干燥細(xì)粉2.000 g，置圓底燒瓶中，用體積分?jǐn)?shù)為90%乙醇加熱回流2次除去雜質(zhì)，去上清液。再取殘?jiān)�加入石油�?0 m L，振蕩30 min后靜置12 h，除去石油醚。加100 m L水，90℃熱水浸提1h，提取2次，將上清液收集濃縮，4倍量體積分?jǐn)?shù)為95%乙醇沉淀數(shù)次，再溶解濃縮置于40 m L離心管中。按濃縮液和蛋白質(zhì)試劑體積比為5:1加Sevage試劑（三氯甲烷與正丁醇體積比5:1），振蕩10 min,離心，取上清液，重復(fù)上述操作5～6次至脫蛋白完全。將除去蛋白質(zhì)的濃縮液加4倍量體積分?jǐn)?shù)為95%乙醇沉淀，并將沉淀物依次用無水乙醇、丙酮洗滌，除去溶劑，真空干燥得粗多糖。

1.3鐵皮石斛多糖測(cè)定方法的優(yōu)化

 1.3.1最大吸收波長(zhǎng)的確定

 精密吸取1 m L的80 μg/m L葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別加入一定量的6%苯酚溶液、濃硫酸溶液，立即水浴保溫一定時(shí)間后，在紫外可見燈掃描進(jìn)行。選擇適當(dāng)?shù)奈�收波長(zhǎng)對(duì)定量分析的特異性和敏感性很重要。

1.3.2紫外分光光度法測(cè)定石斛多糖含量

 稱取10 mg的石斛樣品用蒸餾水定容至50 m L容量瓶，精密吸取該樣品溶液0.5 m L于10 m L具-塞試管中，分別加入一定量的6%苯酚溶液、濃硫酸溶液，立即水浴保溫一定時(shí)間后，在檢測(cè)波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，由標(biāo)準(zhǔn)曲線得出總葡萄糖含量。

  采用上述同樣步驟，精密稱取精制的鐵皮石斛純多糖10 mg，由吸光度測(cè)得該純化后的總葡萄糖量，按公式(1)計(jì)算出換算因子F，并代入公式得出多糖含量。

  F=m/( C x D) (1)

  式中：m------精制的鐵皮石斛多糖質(zhì)量，mg;C------精制的鐵皮石斛多糖測(cè)得的總葡萄糖質(zhì)量濃度，μg/m L; D-精制的鐵皮石斛多糖的稀釋因素。

1.3.3單因素試驗(yàn)

 試驗(yàn)添加鐵皮石斛多糖( Sa)，6%苯酚(P)及濃硫酸( Su)，分別對(duì)樣品添加順序(Sa PSu,Sa SuP，Su SaP，SuPSa，PSaSu，PSuSa)、保溫溫度( 20 0C, 30℃.40℃,50℃,60℃和70℃)、6%苯酚量(0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4和1.6m L)、濃硫酸量(3.5，4.0，4.5，5.0，5.5，6.0, 6.5和7.0 m L)、保溫時(shí)間(5，10，15，20，25，30，35和40 min)影響因素進(jìn)行研究，固定其他條件，得出單因素試驗(yàn)結(jié)果。

1.3.4正交試驗(yàn)的設(shè)計(jì)

 根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果，對(duì)保溫溫度、6%苯酚量、濃硫酸量和保溫時(shí)間進(jìn)行4因素3水平的L9(34)正交試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1。

1.3.5標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

 精密稱量105℃干燥3h至恒重的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品20 mg，用蒸餾水定容至250 m L容量瓶中，配置得80 Vg/m L的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別吸取0，0.1，0.3，0.5，0.7，0.9，1.1和1.3 m L的80 μg/m L葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液，采用優(yōu)化后的多糖測(cè)定方法得出吸光度，并繪制標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖曲線。

1.3.6方法可行性試驗(yàn)

 ①穩(wěn)定性試驗(yàn)。精密吸取0.5 m L多糖樣品溶液，按樣品測(cè)定方法，每隔20，40，60，80，100和120 min測(cè)定一次吸收度，驗(yàn)證方法的穩(wěn)定性。

 ②精密度試驗(yàn)。按樣品測(cè)定方法，吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液( 50 μg/m L) 0.5 m L進(jìn)行精密度試驗(yàn)，連續(xù)進(jìn)行6次，測(cè)定其吸光度，驗(yàn)證方法的精密度。

 ③重現(xiàn)性試驗(yàn)。精確吸取6份0.5 m L多糖樣品溶液，按樣品測(cè)定方法，測(cè)定其吸光度，驗(yàn)證方法的重現(xiàn)性。

 ④加樣回收率試驗(yàn)。精密吸取0.3 m L多糖樣品溶液5份，分別加入質(zhì)量濃度為50μg/m L的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液0.1，0.2，0.3，0.4和0.5 m L，按樣品測(cè)定方法得吸光度，計(jì)算回收率。

2結(jié)果與分析

2.1波長(zhǎng)的選擇

 在360～530 nm處用紫外分光燈掃描的吸光度，結(jié)果如圖1所示。在波長(zhǎng)為490 nm時(shí)吸光度達(dá)到最大，故采用490 nm為最適波長(zhǎng)。

2.2單因素試驗(yàn)

2.2.1樣品添加順序的影響

 固定保溫時(shí)間：30 min；6%苯酚量：0.5 m L；濃硫酸量：4.0 m L；保溫溫度：20℃。根據(jù)試驗(yàn)步驟，最終確定的添加順序是鐵皮石斛多糖( Sa)，6%苯酚(P)及濃硫酸(Su)。試驗(yàn)研究添加的順序是：SaPSu，SaSuP，SuSaP，SuPSa，PSaSu和PSuSa。結(jié)果如圖2所示。結(jié)果顯示，吸收度按依次減弱的順序：PSaSu> SaPSu> SaSuP> SuSaP> SuPSa> PSuSa。添加順序不同的影響因素可能是因?yàn)槎嗵窃诹蛩岬淖饔盟�解成單糖迅速脫水生成糖醛衍生物，與苯酚生成橙黃色化合物，先加入苯酚可能使反應(yīng)更充分，所以試驗(yàn)中按PSaSu順序添加的吸光度較大。

2.2.2保溫溫度的影響

 固定添加順序：PSaSu；6%苯酚量：0.6 m L；保溫時(shí)間：30 min；濃硫酸量：4.0 m L。如圖3所示，溫度在20℃～30℃時(shí)吸光度增加，之后隨著溫度的增加吸光度平緩下降。因?yàn)樵陲@色體系中，隨著溫度的升高，能量釋放的越多，使更多的液體揮發(fā)損失，所以溫度不能超過35℃。

2.2.3  6%苯酚量的影響

 固定添加順序：PSaSu；濃硫酸量：4.0 m L；保溫時(shí)間：30 min；保溫溫度：20℃。在490 nm處測(cè)得6%苯酚量對(duì)吸光度的影響如圖4所示。當(dāng)6%苯酚量在0.2～0.4 m L時(shí)，吸光度明顯增加。當(dāng)6%苯酚量>0.4m L時(shí)，吸光度急劇下降。原因可能是因?yàn)?%苯酚的加入量對(duì)顯色體系中橙色復(fù)合物的形成影響很大。

2.2.4濃硫酸量的影響

 固定添加順序：PSaSu；6%苯酚量：0.6 m L；保溫時(shí)間：30 min;保溫溫度：20℃。濃硫酸的量與顯色體系的pH、顯色試劑的顏色和吸光度有很大的聯(lián)系。如圖5所示，吸光度在開始時(shí)呈上升趨勢(shì)，然后隨著濃硫酸量的增加而降低。當(dāng)濃硫酸量為5.0 m L時(shí)，吸光度最大。

2.2.5保溫時(shí)間的影響

 固定添加順序：PSaSu; 6%苯酚量：0.5 m L;濃硫酸量：4.0 m L;保溫溫度：20℃。在490 nm處不同保溫時(shí)間的吸光度如圖6所示。結(jié)果表明，從5～25 min吸光度隨著保溫時(shí)間的增加而增加。吸光度隨著保溫時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，可能是因?yàn)轱@色反應(yīng)需要很長(zhǎng)時(shí)間才能形成橙色復(fù)合物。但是，在保溫時(shí)間超過25 min后，吸光度開始降低，可能是橙色復(fù)合物發(fā)生了。

2.3正交試驗(yàn)

  根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果設(shè)計(jì)L9(34)正交試驗(yàn)來優(yōu)化顯色反應(yīng)條件，在波長(zhǎng)490 nm處進(jìn)行吸光度測(cè)定，所有試驗(yàn)都進(jìn)行3遍。正交試驗(yàn)的設(shè)計(jì)及結(jié)果如表2所示。

  由表2的結(jié)果顯示，影響苯酚-硫酸法吸光度的因素主次為：C濃硫酸加入量>A保溫溫度>D保溫時(shí)間>B 6%苯酚量，其中濃硫酸的量影響比較顯著。所以正交試驗(yàn)結(jié)果確定的最優(yōu)試驗(yàn)搭配為A3B1C1D1，即保溫溫度30℃，6%苯酚量0.3 m L，濃硫酸量4.5 m L，保溫時(shí)間25 min。通過與條件A1B1C1D1的驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果看，A3B1C1D1條件下的平均吸光度為0.589，因此為最優(yōu)。

2.4葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

  用可見分光光度計(jì)在490 nm處測(cè)定吸光度，以空白樣做參比，以不同質(zhì)量濃度的葡萄糖作為標(biāo)準(zhǔn)單糖測(cè)定的結(jié)果見表3。得葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程：y=0.006 1x+0.004。r2=0.999 6，相關(guān)系數(shù)r=0.999 8，表明葡萄糖濃度在8.0～104.0μg/m L范圍內(nèi)呈良好線性

關(guān)系。

2.5檢出限與定量限

 用校正曲線的斜率和葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液吸光度的標(biāo)準(zhǔn)偏差來估算檢出限與定量限。檢出限與定量限估算值分別為1.1μg/m L和3.33μg/m L。結(jié)果表明，多糖濃度在1.1 μg/m L時(shí)在雜質(zhì)噪音和設(shè)備中能夠明顯地檢測(cè)出噪聲信號(hào)。濃度在3.3μg/m L時(shí)能準(zhǔn)確地量化分析多糖的含量水平。

2.6穩(wěn)定性試驗(yàn)

 為了確定試驗(yàn)具有可重復(fù)性及穩(wěn)定性，在上述確定的最優(yōu)條件下，對(duì)顯色反應(yīng)進(jìn)行穩(wěn)定性試驗(yàn)。取樣品0.5 m L，連續(xù)2h，每隔20 min測(cè)定一次吸光度，觀察其穩(wěn)定性，見表4。結(jié)果表明在顯色120 min內(nèi)吸光度穩(wěn)定性較好。

2.7精密度試驗(yàn)

  按樣品測(cè)定方法，吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液（50μg/m L）0.5 m L進(jìn)行精密度試驗(yàn)，連續(xù)進(jìn)行6次測(cè)定吸光度，得RSD=3.27%< 5%．表明精密度好，結(jié)果見表5。

2.8重現(xiàn)性試驗(yàn)

 精確吸取來自同一批原料的試樣，按樣品測(cè)定方法，分別測(cè)定其吸光度，得RSD=0.005%<5%。表明重復(fù)性較好，結(jié)果見表6。

2.9  回收率試驗(yàn)

 按照樣品測(cè)定方法，測(cè)得樣品中加入葡萄糖溶液的總糖含量，回收率結(jié)果見表7，樣品回收率均在95%～105%之間，表明此法可行。

3結(jié)論

 通過對(duì)影響因子進(jìn)行的單因素試驗(yàn)及L9(34)正交試驗(yàn)得出的最優(yōu)反應(yīng)條件是：溫度30℃；6%的苯酚0.3m L：濃硫酸4.5 m L；保溫時(shí)間25 min;試劑的添加順序：苯酚-樣品-濃硫酸。檢出限與定量限估算值分別為1.1 μg/m L和3.33μg/m L。樣品溶液在顯色反應(yīng)后2h內(nèi)表現(xiàn)出高穩(wěn)定性。校正曲線在8.00～104.00 μg/m L范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.999 6。結(jié)果顯示，優(yōu)化后的苯酚-硫酸法對(duì)鐵皮石斛多糖的測(cè)定具有特異性、準(zhǔn)確性、精密度高的特點(diǎn)，為鐵皮石斛多糖資源的分析與利用提供了重要依據(jù)。