鸚鵡熱衣原體的B598_0590基因編碼包涵體膜蛋白
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李鵬，何君，朱虹，李巖偉，于永慧，端青，宋立華
1．病原微生物生物安全國家重點實驗室，軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所，北京100071；
2．解放軍第264醫(yī)院，山西太原030001
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[摘要]目的：鸚鵡熱衣原體的B598_0590基因與沙眼衣原體的毒力基因CT135同源，本研究旨在分析該基因的表達(dá)和定位。方法：生物信息學(xué)方法分析B598_0590基因的進化地位，比較B598_0590蛋白和沙眼衣原體毒力蛋白crr13s的氨基酸疏水特征；重組表達(dá)、純化鵡熱衣原體的B598_0590蛋白，免疫小鼠制備抗血清；共聚焦免疫熒光觀察鸚鵡衣原體在正常培養(yǎng)條件和使用LpxC抑制劑時B598_0590基因的表達(dá)和定位。結(jié)果：衣原體屬內(nèi)12個種的基因組均含有CT135同源基因，它們編碼的蛋白質(zhì)有相似的疏水特征；B598_0590與CT135的氨基酸同源性為21%；B598_0590的免疫熒光染色特征與包涵體膜蛋白IncA相似，濃染包涵體膜; LpxC抑制劑可抑制網(wǎng)狀體的分裂、包涵體的生長及網(wǎng)狀體向原體轉(zhuǎn)化，包涵體膜蛋白的染色呈現(xiàn)典型的空泡結(jié)構(gòu)。結(jié)論：LpxC抑制劑可用于鑒定未知的鸚鵡熱衣原體包涵體膜蛋白；鸚鵡熱衣原體的B598_0590基因編碼此前尚未鑒定的包涵體膜蛋白。
[關(guān)鍵詞]鸚鵡熱衣原體；包涵體膜蛋白；蛋白定位；CT135；B598_0590
鸚鵡熱衣原體（Chlamydia psittaci，簡稱Cps）是一種專性細(xì)胞內(nèi)寄生的人獸共患病原菌，歸類于衣原體目、衣原體科、衣原體屬。Cps廣泛感染動物，主要導(dǎo)致流產(chǎn)、關(guān)節(jié)炎等，感染人可引起非典型肺炎等疾病。Cps在獨特的包涵體囊泡內(nèi)增殖，有原體和網(wǎng)狀體2種結(jié)構(gòu)形式，分別為感染相和繁殖相。由于易通過氣溶膠一呼吸道傳播和高致病性，Cps被列為生物戰(zhàn)劑和生物恐怖劑。
本研究的對象是Cps B598_0590基因——沙眼衣原體（C.trachomatis，簡稱Ct）的CT135同源基因。在雌鼠生殖道感染模型上，CT135是新發(fā)現(xiàn)的功能未知的毒力因子，與Ct D型菌株的感染持續(xù)時間和導(dǎo)致輸卵管組織增厚等炎癥病理反應(yīng)相關(guān)。該基因在未經(jīng)體外培養(yǎng)的臨床樣本中保持完整，但在細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中易發(fā)生無義或移碼突變，是目前發(fā)現(xiàn)的惟一的衣原體不穩(wěn)定基因，與Ct的體外適應(yīng)性生長有關(guān)。
目前CT135及其同源基因是否編碼蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)的表達(dá)和定位都還不清楚。我們分析了衣原體屬內(nèi)12個種的CT135同源蛋白的系統(tǒng)進化關(guān)系和疏水特征，通過重組表達(dá)Cps的B598_0590、主要外膜蛋白MOMP和包涵體膜蛋白IncA，并制備相應(yīng)抗血清，利用共聚焦免疫熒光分析了B598_0590基因在正常培養(yǎng)條件和使用LpxC抑制劑時的表達(dá)和定位，為下一步深入研究CT135及其同源基因的致病機制奠定了基礎(chǔ)。
1 材料和方法
1.1材料
HeLa229細(xì)胞、Cps菌株CG1、pGEX4T-l原核表達(dá)載體由本室保存；大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞、DNA提取試劑盒、PCR純化試劑盒購自博邁德公司；限制性內(nèi)切酶、T。DNA連接酶、質(zhì)粒提取試劑盒購自TaKaRa公司；熒光二抗488、DAPI購自Life Tech-nology公司；Q5 DNA聚合酶購白NEB公司；引物由上海生工公司合成。
1.2 生物信息學(xué)分析衣原體屬CT135同源基因
使用NCBI數(shù)據(jù)庫，通過蛋白序列同源性比對，發(fā)現(xiàn)GenBank中衣原體屬所有12個衣原體種CT135同源基因的基因號，利用Geneious軟件對CT135同源蛋白進行同源性分析，繪制同源關(guān)系進化樹；使用DNASTAR軟件分析B598_0590和CT135蛋白的疏水特征。
1.3 蛋白表達(dá)純化
以Cps CG1株基因組為模板，采用引物對(F:TCCCCCGGGTGAGGCGGAGTCCGCTTTTG; R: CCCTCGACrTATTGCCCTGAACGGATCGC)和Q5 DNA聚合酶擴增B598_0590基因；PCR產(chǎn)物經(jīng)Sma I和Xho I酶切后，與經(jīng)同樣酶切處理的載體pGEX4T-l連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21；工程菌培養(yǎng)至D600n。、為0.8，加入1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)1、2和3h時取樣，分析蛋白的表達(dá)；取誘導(dǎo)2h的L程菌，超聲波裂解后收集包涵體蛋白，用PBS、2 mol/L尿素和純水分別洗滌3次；將洗滌后的包涵體蛋白用PBS重懸，超聲波3h后置-30℃備用。
1.4免疫動物制備抗體
取重組包涵體蛋白50 ug與等體積的完全弗氏佐劑乳化后，行小鼠腹腔注射；初次免疫后的第14d，用50ug重組蛋白與等體積的不完全弗氏佐劑乳化后進行第2次免疫；第2次免疫后7d，用50ug重組蛋白與等體積的不完全弗氏佐劑乳化后進行第3加強免疫；第3次免疫后1周，小鼠眼球摘除取血，分離抗血清。
1.5激光共聚焦免疫熒光觀察蛋白定位
用Cp.s CG1感染HeLa229細(xì)胞，培養(yǎng)基為含有1 ug/mL放線菌酮和10%胎牛血清的DMEM，或加入1 ug/mL LPC-OI1（LpxC抑制劑lsl），感染30 h后甲醇同定，以1：100稀釋的抗血清為一抗、1：800稀釋的熒光二抗488進行免疫染色，以主要外膜蛋白MOMP和包涵體膜蛋白IncA為對照，激光共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果。
2結(jié)果
2.1 生物信息學(xué)分析衣原體屬CT135同源基因
通過氨基酸序列比對，發(fā)現(xiàn)衣原體屬內(nèi)的12個種一致存在CT135同源基因，它們的蛋白質(zhì)進化關(guān)系見圖1A，與基于16S rDNA的進化樹很相似，說明CT135同源基因是衣原體屬的保守基因。CT135與B598_0590蛋白的同源性不高，只有21%，但二者具有相似的疏水特征（圖1B），特別是CT135同源蛋白一致含有約60個氨基酸殘基組成的2個連續(xù)的疏水裂片（圖1B框區(qū)），這是衣原體包涵體膜蛋白的一個特征。因此，生物信息學(xué)分析提示CT135同源基因可能編碼保守的包涵體膜蛋白。
2.2 8598_0590蛋白的表達(dá)與純化
PCR擴增出的目的片段經(jīng)酶切、連接載體后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21構(gòu)建原核表達(dá)菌株，菌株于37。C經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，分別于1、2和3h取樣，全菌SDS-PAGE分析，相對蛋白分子質(zhì)量約59xl03處有明顯的蛋白條帶，與預(yù)期一致，且在誘導(dǎo)2h時表達(dá)量最高；超聲波破菌后分析，目的蛋白以包涵體的形式大量表達(dá)，隨后經(jīng)梯度離心和洗滌，獲得了較純的包涵體蛋白（圖2）。
2.3 共聚焦免疫熒光證實B598_0590基因編碼包涵體膜蛋白
正常培養(yǎng)條件下感染后30 h（圖3A、B、C），Cps進入發(fā)育周期的中后期，包涵體發(fā)育成熟，其形狀不規(guī)則，充滿了衣原體顆粒；菌體主要外膜蛋白MOMP和包涵體膜蛋白IncA有顯著不同的免疫熒光染色特征，這是因為MOMP和IncA分別分布在菌體外膜和包涵體膜上；B598_0590的染色特征與IncA有相似之處，可以濃染包涵體膜，但二者也有顯著差異。IncA抗體均一地只染色包涵體膜，而B598_0590抗體在個別包涵體中可以只濃染包涵體膜，多數(shù)情況下濃染包涵體膜和在包涵體內(nèi)部著色。這說明B598_0590編碼包涵體膜蛋白，但其表達(dá)和分泌與IncA有差異。
在培養(yǎng)基中加入LpxC抑制劑時（圖3D、E、F），Cps的類脂A合成途徑被抑制，原體轉(zhuǎn)化為體積巨大的網(wǎng)狀體，網(wǎng)狀體僅可進行有限次數(shù)的分裂，包涵體的生長及網(wǎng)狀體向原體的轉(zhuǎn)化也被抑制，可觀察到MOMP分布在菌體內(nèi)部，說明MOMP不能正常分泌表達(dá)；IncA可部分地正常分泌表達(dá)，其抗體的免疫熒光染色呈現(xiàn)典型的空泡結(jié)構(gòu)；B598_0590抗體的免疫熒光可觀察到類似IncA的空泡結(jié)構(gòu)。以上說明在有LpxC抑制劑時，包涵體膜蛋白至少可以部分地正常表達(dá)分泌，再次證實了B598_0590編碼包涵體膜蛋白。
3討論
傳統(tǒng)的衣原體包涵體膜蛋白鑒定都是在正常培養(yǎng)條件下進行的，該方法的一個問題是很多包涵體膜蛋白不是均一地在包涵體膜上分布，有時在包涵體內(nèi)部或菌體表面也有分布，這給判斷蛋白質(zhì)是否分泌到包涵體膜上帶來了干擾，B598_0590即是一個例子。本研究測試了LpxC抑制劑對Cps生長發(fā)育的影響，發(fā)現(xiàn)LpxC抑制劑可抑制網(wǎng)狀體的分裂和包涵體的生長。LpxC抑制劑干擾了MOMP的分泌，可能也會影響Ⅲ型分泌系統(tǒng)的組裝，但不影響已有的Ⅲ型分泌系統(tǒng)發(fā)揮功能。由于包涵體膜蛋白是Ⅲ型分泌系統(tǒng)的底物及包涵體中的菌體數(shù)量有限，包涵體膜蛋白的免疫熒光可觀察到典型的包涵體空泡結(jié)構(gòu)，這為鑒定Cps的包涵體膜蛋白提供了一種易觀察的方法。另外，據(jù)國外報道LpxC抑制劑不影響Ct的包涵體生長和菌體分裂，顯然LPS對不同衣原體種的生長發(fā)育有不同的作用。
衣原體的包涵體是宿主與菌體的中介，包涵體膜蛋白無疑是重要的毒力因子。但不同衣原體種的包涵體膜蛋白種類變化較大，這可能與衣原體不同的宿主和組織嗜性相關(guān)。我們發(fā)現(xiàn)B598_0590或CT135的同源基因是衣原體屬特異，并通過2種方法一致鑒定B598_0590基因編碼包涵體膜蛋白，這使得衣原體屬特異性的包涵體膜蛋白種類又增加了一個。我們發(fā)現(xiàn)B598_0590蛋白的定位與IncA有差異，前者在包涵體內(nèi)部也有分布，說明B598_0590可能預(yù)裝在菌體表面并在感染早期發(fā)揮作用。作為一個新發(fā)現(xiàn)的毒力因子，CT135在衣原體的體外適應(yīng)性生長和延長體內(nèi)的感染時問中發(fā)揮了重要作用，但相關(guān)機制還不清楚。本研究為下一步深入探討B(tài)598_0590或CT135同源基因的功能奠定了基礎(chǔ)。
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