STAT3對PTEN缺失的HGC27細(xì)胞增殖的影響
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田秉昌，衛(wèi)勃，喬振宇，呂曉業(yè)，黃芳，王芃，李山虎，周建光，王健，劉文忠
1．內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特010059;
2．軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所，北京100850;
3．解放軍總醫(yī)院普外科，北京100853;
4．貴陽醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，貴州貴陽550001
——[摘要]目的：初步探索STA'113與HGC27胃癌細(xì)胞增殖的關(guān)系。方法：用T DNA連接酶將外源片段與酶切后的pLKO.l載體連接，將構(gòu)建的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，48 h后收集上清用于感染HGC27細(xì)胞，Wescern印跡檢測蛋白的表達(dá)，生長實驗檢測其對腫瘤細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果：基因測序和雙酶切鑒定表明敲低STAT3質(zhì)粒構(gòu)建成功；慢病毒質(zhì)粒有效抑制HGC27細(xì)胞中STA'r3蛋白水平，抑制STAT3對HCC27細(xì)胞的增殖有明顯抑制作用。結(jié)論：在PTEN缺失的HGC27胃癌細(xì)胞中s'rAT3促進(jìn)腫瘤增殖，但STAT3并不是在所有PTEN缺失的腫瘤細(xì)胞中都發(fā)揮抑制腫瘤形成的作用。
[關(guān)鍵詞] TAT3；P'rEN；胃癌；HGC27細(xì)胞
胃癌是起源于胃黏膜上皮的惡性腫瘤，目前病死率居各類腫瘤的第二位。大多數(shù)胃癌確診病人都是晚期或發(fā)生了惡性轉(zhuǎn)移，病人手術(shù)后往往會因復(fù)發(fā)導(dǎo)致死亡，5年存活率不到30%。近年來胃癌的分子靶向性治療日益受到研究者的關(guān)注。信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄活化蛋白( STAT)是一類由細(xì)胞因子、生長因子等多肽類配體激活的轉(zhuǎn)錄因子，包括7個家族成員，即STATl、2、3、4、Sa、5b和61 21。其中，STAT3與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，一系列體內(nèi)外實驗研究表明組成型活性的STAT3激酶參與腫瘤的發(fā)生及惡性進(jìn)展，因此通常STAT3被認(rèn)為是一種癌基因。但在最近研究中也發(fā)現(xiàn)STAT3具有抑制腫瘤的作用，比如在遺傳背景為PTEN表達(dá)缺失的神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中，STAT3就具有抑制腫瘤增殖和侵襲的能力。HGC27是一株未分化的PTEN表達(dá)缺失的胃癌細(xì)胞系，本研究旨在探討在這種遺傳背景下STAT3對HGC27胃癌細(xì)胞是發(fā)揮促進(jìn)還是抑制腫瘤增殖的作用，從而為胃癌的臨床靶向性治療提供一定的研究基礎(chǔ)。
1材料與方法
1.1材料
293T、HGC27細(xì)胞和pLKO.l載體為本實驗室保存；DMEM、胰酶購自GIBCO公司；限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶為TaKaRa公司產(chǎn)品；PCR回收試劑盒、膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒均購自威格拉斯生物技術(shù)公司；胎牛血清購自杭州四季青公司；7-tu-bulin、STAT3、pSTAT3( Tyr705)抗體購白圣克魯斯生物技術(shù)公司；轉(zhuǎn)染試劑購自威格拉斯生物技術(shù)（北京）有限公司；CCK8細(xì)胞計數(shù)試劑盒購于東仁化學(xué)科技有限公司。
1.2細(xì)胞培養(yǎng)
293T、HGC27細(xì)胞用含10%胎牛血清、50 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，在5%的CO2孵箱中培養(yǎng)。
1.3抑制STAT3表達(dá)的慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定
根據(jù)STAT3基因序列設(shè)計干擾STAT3表達(dá)的shRNA上、下游引物shSTAT3-F（5，-CCGGCGGCGTCCAGTTCACTACTAACTGCAGTTAGTAGTGAACTGGACGCCCJTTTTTG-3 7）和shSTAT3-R(5,- AATTCAAAAACGGCGTCCAGTTCACTACTAACTGCAGTTAGTAGTGAACTGGACGCCG- 3，)，退火；用Age I和EcoR I雙酶切pLKO.l載體(37。C，2 h)并回收線性化載體；將退火后的STAT3 RNAi序列連接入pLKO.I載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a.，挑選克隆，振蕩培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，用P.st I和BamH I雙酶切鑒定，酶切鑒定正確的克隆送天一輝遠(yuǎn)生物公司測序。
1.4慢病毒載體的包裝
將293T細(xì)胞接種到10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，接種量70%—80%，轉(zhuǎn)染前2h換成含新生胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液。按照轉(zhuǎn)染試劑說明書將重組質(zhì)粒和Vigofect轉(zhuǎn)染試劑分別用DMEM按比例稀釋，5 min后混合靜置30 min后滴入293T細(xì)胞，用同樣的方法轉(zhuǎn)染對照質(zhì)粒，12 h后更換含新生胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，48 h后收取上清，用濾器過濾后將病毒液分裝，-80。C保存。
1.5病毒感染HGC27細(xì)胞
感染前一天將HGC27細(xì)胞接種到60 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，密度為70%—80%，感染時將5 mL病毒上清、培養(yǎng)液和聚凝胺( polybrene)混勻滴入HGC27細(xì)胞，12 h后換液，48 h用嘌呤霉素進(jìn)行篩選。
1.6Western印跡
將蛋白樣品加入5xSDS加樣緩存液，煮沸10min后行SDS-PAGE，之后濕轉(zhuǎn)至醋酸纖維膜上，用5%脫脂奶粉在搖床上封閉30 min，加入稀釋的一抗，4℃搖床過夜，用TBST洗膜液洗3次，每次5min，加入稀釋的二抗，室溫6 h，之后用TBST洗膜3次，每次5 min，在暗室中用化學(xué)發(fā)光液顯影、定影。
1.7 CCK8細(xì)胞增殖實驗
將敲低STAT3表達(dá)的HGC27和對照細(xì)胞接種至96孔板中，每孔1000個細(xì)胞，在不同時間點加10uL CCK8試劑，37C放置2h后測量D45(h。，值，以時間為橫坐標(biāo)、D450mn值為縱坐標(biāo)繪制生長曲線。
2結(jié)果
2.1 敲低STAT3基因慢病毒載體的構(gòu)建、鑒定
設(shè)計STAT3干擾引物序列時，在鉸鏈區(qū)引入了一個PstI酶切位點，載體pLKO.l上沒有該位點。用Psi I和BamH I雙酶切質(zhì)粒后如能獲得2條長度分別約為6300和600 bp的條帶，則表明敲低STAT3基因表達(dá)的干擾序列已插入載體。酶切鑒定表明得到了陽性克隆（圖1），DNA測序結(jié)果顯示慢病毒載體構(gòu)建成功。
2.2 Western印跡檢測慢病毒感染后HCJC27細(xì)胞中STAT3蛋白水平
用敲低STAT3的慢病毒顆粒感染HGC27細(xì)胞，經(jīng)嘌呤霉素篩選后得到穩(wěn)定感染慢病毒載體的細(xì)胞系。Western印跡檢測發(fā)現(xiàn)STAT3蛋白表達(dá)水平顯著降低，說明srrAT3慢病毒載體有效干擾了細(xì)胞中STAT3蛋白的表達(dá)（圖2）。
2.3 生長曲線檢測抑制STAT3表達(dá)對HGC27細(xì)胞增殖的影響
為了探討HGC27細(xì)胞中STAT3活性對其增殖是正調(diào)控還是負(fù)調(diào)控，用CCK8試劑盒檢測敲低STAT3表達(dá)后對HGC27細(xì)胞生長的影響，發(fā)現(xiàn)敲低STAT3表達(dá)的HCJC27細(xì)胞生長明顯慢于對照細(xì)胞，說明在PTEN缺失的HGC27細(xì)胞中STAT3蛋白發(fā)揮促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長的作用（圖3）。
3討論
在腫瘤的發(fā)病機(jī)制、預(yù)防和治療手段中，信號傳導(dǎo)途經(jīng)的研究越來越受到人們的重視。其中JAK-STAT通路與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展息息相關(guān)，其家族中的STAT3與JAK/STAT、P13K/Akt/mTOR、Ras/Raf/MAPK等通路有關(guān)，處于這些信號通路的交匯點。STAT3是重要的核轉(zhuǎn)錄因子，同時也是EGF、11-6／JAK、Src等多個致癌性酪氨酸激酶信號通道匯聚的焦點。研究發(fā)現(xiàn)STAT3信號通路的異常激活對腫瘤細(xì)胞的增殖、血管發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移發(fā)揮重要的作用。當(dāng)抑制STAT3表達(dá)后，加快了腫瘤細(xì)胞的凋亡和減少了腫瘤血管的形成。乳腺癌細(xì)胞中自分泌的STAT3對細(xì)胞增殖發(fā)揮重要作用，同時也有研究發(fā)現(xiàn)STAT3和結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖、侵襲、血管發(fā)生和轉(zhuǎn)移有關(guān)，這一調(diào)節(jié)主要是通過Bcl-2、p21wafl/cipl，p27kipl、E-cadherin、VEGF和MMP的表達(dá)。雖然現(xiàn)階段研究主要集中在不同遺傳背景下STAT3活性的增高促進(jìn)腫瘤的形成，但也有研究發(fā)現(xiàn)在PTEN缺失的神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中STAT3發(fā)揮了抑制腫瘤生長的作用，并且這一作用可能與信號通路的補(bǔ)償有關(guān)。但我們在PTEN缺失的HGC27細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)STAT3分子還是促腫瘤的。我們用干擾STAT3表達(dá)的慢病毒顆粒感染HGC27細(xì)胞后進(jìn)行Western印跡檢測，同時做了細(xì)胞生長實驗，發(fā)現(xiàn)敲低STAT3后HGC27細(xì)胞生長明顯變慢，說明STAT3在PTEN缺失的胃癌細(xì)胞中依然是癌基因。這也提示我們在相同的遺傳背景下，不同類型腫瘤細(xì)胞中STAT3也發(fā)揮不一樣的生物學(xué)功能。雖然目前尚不清楚STAT3信號通路為什么在PTEN缺失的這一遺傳背景下扮演不同的角色，但這一結(jié)果可以對胃癌病人分子靶向性治療及個性化治療提供一定的研究基礎(chǔ)。
