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王禮強(qiáng)，袁伯川，馬永生，楊瑞，周姍，劉穎

北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京100102

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[摘要]目的：構(gòu)建甘草根特異性過表達(dá)3-羥基-3-甲基戊二酰CoA還原酶(HMCR)基因毛狀根培養(yǎng)體系。方法：利用根特異性過表達(dá)甘草HMGR基因的植物雙元表達(dá)載體，通過發(fā)根農(nóng)桿菌ACCC10060介導(dǎo)，轉(zhuǎn)化甘草外植體并誘導(dǎo)毛狀根的形成，利用PCR法及測序法對轉(zhuǎn)基因毛狀根進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果：誘導(dǎo)得到大量生長良好的甘草根特異性過表達(dá)HMGR基因毛狀根。結(jié)論：為進(jìn)一步研究功能基因HMGR與甘草酸次生代謝的相關(guān)性，以及提高甘草毛狀根中的甘草酸含量奠定了良好的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

[關(guān)鍵詞]甘草；毛狀根；3-羥基-3-甲基戊二酰CoA還原酶

 甘草是我國最常用的大宗藥材之一，甘草酸是其最主要的活性成分，具有抗炎、抗癌、抗病毒等諸多作用。但目前栽培甘草作為主流商品甘草，普遍存在品質(zhì)退化和甘草酸含量低等問題，難以達(dá)到《中國藥典》和《日本藥典》規(guī)定的甘草酸含量不低于2.0%和2.5%的合格標(biāo)準(zhǔn)，既影響甘草飲片的臨床療效，也影響含甘草酸藥品的生產(chǎn)。因此，結(jié)合分子生物學(xué)技術(shù)開展甘草酸代謝途徑的研究，挖掘功能基因與甘草酸合成的相關(guān)性，對于提高栽培甘草以及離體培養(yǎng)體系中甘草酸的含量均具有重要意義。

 目前，甘草酸的代謝途徑已闡明，它是通過甲羥戊酸(mevalonic acid，MVA)途徑合成的，此途徑受為數(shù)眾多的關(guān)鍵酶的調(diào)節(jié)，而3-羥基-3-甲基戊二酰CoA還原酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA re-ductase，HMGR)是該途徑的第一個限速酶，對于甘草酸的合成具有至關(guān)重要的作用。因此，對HMGR基因開展相關(guān)研究，可在一定程度上揭示甘草酸合成的分子機(jī)制，從而有望提高甘草酸的積累水平。

 高等植物的毛狀根由于可以合成植物特征的次生代謝產(chǎn)物，對于資源植物的保護(hù)及可持續(xù)發(fā)展具有重要意義，因此受到越來越多的關(guān)注，目前已廣泛應(yīng)用于植物次生代謝產(chǎn)物生產(chǎn)、品種改良和特種植物栽培等領(lǐng)域。近年來甘草毛狀根培養(yǎng)的研究主要集中于空白毛狀根的建立及培養(yǎng)過程的控制方面，如盧虹玉等和劉義等報道了甘草毛狀根培養(yǎng)體系的建立以及主要次生代謝產(chǎn)物含量的測定，郭生虎等和謝麗瓊等則對甘草毛狀根培養(yǎng)過程中不同理化因子對其生長的影響進(jìn)行了探討。雖然也有學(xué)者嘗試了過表達(dá)鯊烯合酶(squalene synthase，SQS)基因甘草毛狀根的誘導(dǎo)研究，但到目前為止，對于甘草酸代謝途徑中的第一個限速酶HMGR的相關(guān)研究仍屬空白。因此，我們以HMCR為目的基因，擬構(gòu)建甘草根特異性過表達(dá)HMGR基因毛狀根，以期為揭示甘草酸生物合成的分子機(jī)制及提高甘草酸的離體培養(yǎng)積累水平奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

 甘草無菌苗自烏拉爾甘草（Clycyrrhiza uralen-SLS）種子無菌培養(yǎng)獲得；發(fā)根農(nóng)桿菌ACCC10060購白中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心；含目的基因（煙草TobRb7啟動子和甘草HMGR基因）的植物雙元表達(dá)載體為本實(shí)驗(yàn)室保存。

 LB培養(yǎng)基、YEB培養(yǎng)基所需藥品和各類抗生素購自北京拜耳迪生物技術(shù)有限公司；6，7-V、MS基本培養(yǎng)基所需大量元素、微量元素、有機(jī)物等，以及乙醇、升汞、98%硫酸（分析純）均購于北京化學(xué)試劑公司；高純質(zhì)粒小量快速提取試劑盒（離心柱型）、廣譜植物總DNA提取試劑盒、DNA marker(BM2000)均購于北京博邁德科技發(fā)展有限公司；引物合成及測序均由上海生工生物工程公司完成。

 Sigma 3K-15低溫高速離心機(jī)；Anke TGL-16G離心機(jī)；JS-680B全自動凝膠成像分析儀（上海培清科技有限公司）；Bio-Rad電泳儀；SANYO -80CC超低溫冰箱；TECHNETC-3000 PCR擴(kuò)增儀；GEANT制冰機(jī)；JA1103N千分之一精密電子天平；L-901渦旋震蕩儀（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；微量移液器（Eppendorf公司）。

1.2發(fā)根農(nóng)桿菌ACCC10060感受態(tài)細(xì)胞的制備

 活化發(fā)根農(nóng)桿菌ACCC10060，取5 mL菌液轉(zhuǎn)入10 mL無菌離心管中，4℃、4000 r/min離心10min，棄上清，用3 mL冰上預(yù)冷的無菌水輕輕吹打，重懸沉淀，4℃、4000 r/min離心10 min。重復(fù)上述步驟2次，即得發(fā)根農(nóng)桿菌ACCC10060感受態(tài)細(xì)胞。

1.3  根特異性過表達(dá)HMGR基因ACCC10060工程菌的構(gòu)建

 采用博邁德高純質(zhì)粒小量快速提取試劑盒（離心柱型）從本實(shí)驗(yàn)室保存的攜帶煙草TobRB7啟動子及甘草HMGR基因的大腸桿菌工程菌中提取重組質(zhì)粒pCA-tob-HMGR;取1.2中制備好的發(fā)根農(nóng)桿菌ACCC10060感受態(tài)細(xì)胞置于冰上，加入重組質(zhì)粒pCA-Tob-HMGR,輕輕混勻；將質(zhì)粒感受態(tài)混合物加入預(yù)冷的0.1 cm電擊杯中進(jìn)行電擊（電轉(zhuǎn)儀設(shè)置條件為C:25 p4F;PC:200 C1;U:2400 V）；取出電擊杯，加入500 U,L預(yù)冷的YEB培養(yǎng)基，輕輕混勻，轉(zhuǎn)入無菌1.5 mL離心管中，28。C、200 r/min復(fù)蘇3h；取復(fù)蘇的菌液150 poL涂在含卡那霉素(50 mg/L)和潮霉素(20 mg/L)的YEB平板上，室溫放置至菌液完全吸收后，于28。C黑暗條件下倒置培養(yǎng)48 h。

1.4  根特異性過表達(dá)HMCR基因ACCC10060工程菌的驗(yàn)證

挑取平板上的多個單菌落，分別轉(zhuǎn)入10 mLYEB液體培養(yǎng)基(添加卡那霉素50 mg/L和潮霉素20 mg/L)中，于280C、180 r/min振蕩培養(yǎng)過夜。提取質(zhì)粒作為模板進(jìn)行PCR驗(yàn)證。據(jù)文獻(xiàn)報道設(shè)計PCR引物（表1）。反應(yīng)體系：ddH：0 10.0 111，2xTaq PCR Mix 15.0 uL，模板2.0 uL，兩端引物各1.5 uL。TobRb7啟動子和HMCR基因反應(yīng)條件：94℃5 min;94℃ 50 s,52.C 50 s,72C 90 s,35個檐環(huán)；72℃10 min；4℃保存。rolC基因反應(yīng)條件：94℃5 min;94℃ 30 s,55℃30 s,72℃1 min,35個循環(huán)；72℃10 min；4℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后送上海生T生物工程公司測序，用NCBI網(wǎng)站的Blast工具，在線比較測得序列與甘草HMGR基因、煙草TobRB7啟動子及發(fā)根農(nóng)桿菌rolC基因的相似度。

1.5根特異性過表達(dá)HMGR基因甘草毛狀根的誘導(dǎo)、培養(yǎng)及鑒定

 將驗(yàn)證正確的根特異性過表達(dá)HMGR基因ACCC10060工程菌接種于YEB液體培養(yǎng)基（添加卡那霉素50 mg/L和潮霉素20 mg/L）中，28CC振蕩培養(yǎng)，活化3次至D60。。。約為0.5，菌液于5000 r/min離心5 min，棄上清，并用MS液體培養(yǎng)基稀釋至原菌液體積。甘草種子經(jīng)表面滅菌后在MS同體培養(yǎng)基上萌發(fā)，7d后取甘草下胚軸為外植體，用刀片輕劃幾道傷口，用上述菌液侵染20 min后，用無菌濾紙吸干菌液，轉(zhuǎn)接到6，7-V固體培養(yǎng)基上，共培養(yǎng)2d，然后用含400 mg/L頭孢霉素(cefotaxime，Cef)水溶液及無菌水浸泡沖洗后轉(zhuǎn)入含400 mg/L Cef的6，7-V同體培養(yǎng)基上，25℃暗培養(yǎng)，5～6 d更換培養(yǎng)基，直至獲得無菌毛狀根。取新鮮毛狀根l g，用廣譜植物基因組提取試劑盒提取總DNA作為模板，采用表1中的引物及1.4中相應(yīng)的PCR反應(yīng)體系和條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對反應(yīng)產(chǎn)物電泳檢測及測序分析。

2結(jié)果

2.1  根特異性過表達(dá)HMGR基因ACCC10060工程菌的構(gòu)建及驗(yàn)證

對電轉(zhuǎn)化后獲得的陽性克隆進(jìn)行PCR，結(jié)果如圖1，分別獲得了長度約為1700（圖1A，與甘草HMGR基因長度一致）、730(圖1B，與TobRB7啟動子長度一致)、580 bp（圖IC，與rolC基因長度一致）的基因片段。PCR結(jié)果初步說明根特異性過表達(dá)HMGR基因ACCCI0060工程菌構(gòu)建成功。

PCR檢測為陽性的菌液測序結(jié)果如圖2。由圖2A可知，長度為1663 hp的條帶與甘草HMCR基因的cDNA序列相似度為99%；由圖2B可知，長度為690 bp的條帶與煙草TobRB7啟動子序列相似度為99%;由圖2C可知，長度為547 bp的條帶與發(fā)根農(nóng)桿菌的roIC基因相似度為98%。因此，測序結(jié)果進(jìn)一步證明根特異性轉(zhuǎn)甘草HMGR基因發(fā)根農(nóng)桿菌工程菌構(gòu)建成功。

2.2根特異性過表達(dá)HMCR基因甘草毛狀根的誘導(dǎo)

經(jīng)過40 d左有的培養(yǎng)，得到了生長良好的甘草毛狀根，如圖3所示。

2.3根特異性過表達(dá)HMGR基因甘草毛狀根的驗(yàn)證

對獲得的毛狀根進(jìn)行PCR及測序驗(yàn)證。PCR驗(yàn)證結(jié)果如圖4。圖4A顯示獲得了長度約為1700 bp的條帶，與甘草HMGR基因長度一致；圖4B顯示獲得了長度約為730 bp的條帶，與煙草TobRB7啟動子長度一致；圖4C顯示獲得了長度約為580 bp的條帶，與發(fā)根農(nóng)桿菌rolC基因長度一致。PCR結(jié)果初步說明培養(yǎng)得到了根特異性過表達(dá)HMGR基因甘草毛狀根。

同樣將PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序分析，并采用Blast工具比較相似度，結(jié)果如圖5。由圖5A可知，長度為1663 bp的條帶與甘草HMGR基因的cDNA序列相似度為99%；由圖SB可知，長度為690 bp的條帶與炯草TobRB7啟動子序列相似度為99%；由圖SC可知，長度為547 bp的條帶與發(fā)根農(nóng)桿菌的roIC基因相似度為99%。因此，測序結(jié)果進(jìn)一步證明已成功誘導(dǎo)得到根特異性過表達(dá)HMCR基因甘草毛狀根。

3討論

 盧虹玉等曾報道利用發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將甘草鯊烯合酶基因在毛狀根中過表達(dá)，所獲得的轉(zhuǎn)SQS基因毛狀根中甘草酸最高含量約為野生型毛狀根的3.6倍，證明在甘草毛狀根中過表達(dá)甘草酸代謝途徑中的功能基因可以提高毛狀根中甘草酸的積累水平。HMGR是甘草酸代謝途徑中的第一個限速酶，對甘草酸的生物合成具有重要的調(diào)控作用。我們在本研究中誘導(dǎo)得到根特異性過表達(dá)HMGR基因甘草毛狀根，為進(jìn)一步揭示HMCR基因在甘草酸代謝中的功能奠定了重要基礎(chǔ)，并有望通過基因工程手段來提高離體培養(yǎng)中甘草酸的積累水平，對于甘草資源的可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。