植物增殖細(xì)胞核抗原的結(jié)構(gòu)與功能
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李治龍，李晗，李曉嶼，李玉花，藍(lán)興國(guó)
東北林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院發(fā)育生物學(xué)研究室，黑龍江哈爾濱150040
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[摘要]增殖細(xì)胞核抗原( PCNIA)是真核生物細(xì)胞中一類保守蛋白，在DNA復(fù)制、DNA修復(fù)及細(xì)胞周期調(diào)控過(guò)程中具有非常重要的作用。我們簡(jiǎn)要介紹植物PCNA的結(jié)構(gòu)、表達(dá)調(diào)控及其功能的研究進(jìn)展。
[關(guān)鍵詞]增殖細(xì)胞核抗原；表達(dá)調(diào)控；DNA復(fù)制；DNA修復(fù)；細(xì)胞周期調(diào)控
增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear anti-gen，PCNA)最初在系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者的血清中首次發(fā)現(xiàn)并命名。此后，在酵母和哺乳動(dòng)物的研究中發(fā)現(xiàn)，PCNA在DNA復(fù)制、修復(fù)和細(xì)胞周期調(diào)控等過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。近年來(lái)，在植物PCNA研究方面取得了一些新的進(jìn)展。在此，我們簡(jiǎn)要綜述植物中的PCNA結(jié)構(gòu)、表達(dá)調(diào)控及其功能。
1 PCNA的結(jié)構(gòu)
目前，已在水稻、長(zhǎng)春花、大豆、油菜、豌豆、胡蘿卜、玉米、擬南芥、煙草和紅花菜豆等植物中發(fā)現(xiàn)了PCNA（表1）。大豆、水稻、長(zhǎng)春花、油菜、豌豆等植物的基因組至少編碼1個(gè)PCNA，而胡蘿卜、玉米、擬南芥、炯草和紅花菜豆等的基因組編碼至少2個(gè)PCNA。
模式植物擬南芥基因組至少編碼2個(gè)PCNA，它們?cè)诎被嵝蛄猩暇哂?7%的一致性，只有9個(gè)氨基酸殘基的差異。每一個(gè)PCNA蛋白單體由2個(gè)相似的亞基組成，每個(gè)亞基由一個(gè)域間連接環(huán)(in-terdomain connecting loop，IDCL)連接每個(gè)亞基的C端和N端。擬南芥PCNA雙分子熒光互補(bǔ)和生化實(shí)驗(yàn)表明，2種PCNA蛋白單體PCNA1和PCNA2可以結(jié)合形成4種同源、異源三聚體環(huán)狀結(jié)構(gòu)，分別為亞基1/1/1、1/1/2、1/2/2和2/2/21。對(duì)PCNA三聚體晶體結(jié)構(gòu)的分析表明，PCNA由3個(gè)亞基頭尾相連構(gòu)成一個(gè)三聚體環(huán)，呈偽六重軸對(duì)稱結(jié)構(gòu)，PCNA環(huán)的外層是B折疊，內(nèi)層富含Q螺旋（圖1）。此外，對(duì)酵母、人、古細(xì)菌、寄生原蟲(chóng)、黑腹果蠅和蝦的PCNA晶體結(jié)構(gòu)的研究發(fā)現(xiàn)，這些物種的PCNA都構(gòu)成三聚體環(huán)狀結(jié)構(gòu)，表明PCNA結(jié)構(gòu)在各物種間高度保守。
2 PCNA的表達(dá)調(diào)控
PCNA在植物各組織中都有所表達(dá)，而且在細(xì)胞增殖旺盛的組織中的表達(dá)水平高于成熟組織及非分化細(xì)胞，如玉米的根尖、芽、小穗和穗軸，水稻的根和根尖，以及萌發(fā)初期的紅花菜豆中，PCNA表達(dá)水平非常高；而在玉米成熟的葉、穗、花粉，水稻成熟葉，萌發(fā)前和萌發(fā)后期的紅花菜豆中，PCNA表達(dá)水平相對(duì)較低。
對(duì)水稻PCNA啟動(dòng)子區(qū)的分析發(fā)現(xiàn)，其啟動(dòng)子上有2個(gè)蛋白結(jié)合位點(diǎn)11a和11b，這2個(gè)位點(diǎn)通過(guò)特異結(jié)合PCF1和PCF2蛋白，調(diào)節(jié)PCNA組織特異性的表達(dá)。PCNA的表達(dá)也受到E2F的調(diào)節(jié)，在對(duì)煙草PCNA啟動(dòng)子的研究中發(fā)現(xiàn)，E2F通過(guò)與PCNA啟動(dòng)子區(qū)2個(gè)不同的結(jié)合位點(diǎn)作用，調(diào)控PCNA在成熟組織和幼嫩組織中的表達(dá)差異。Noir等研究發(fā)
現(xiàn)PCNA啟動(dòng)子包含順式調(diào)節(jié)元件siteⅡmotif和telobox，表明PCNA的表達(dá)受細(xì)胞周期的影響。除了轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控外，在擬南芥種子萌發(fā)過(guò)程中，脫落酸通過(guò)抑制PCNA1基因的表達(dá)水平，從而抑制擬南芥種子的萌發(fā)。
在酵母和哺乳動(dòng)物PCNA的研究中發(fā)現(xiàn)，通過(guò)對(duì)PCNA泛素化和SUMO化的修飾，可以調(diào)節(jié)PCNA蛋白的功能。PCNA單泛素化(monoubiquitinat-ed PCNA)可以促進(jìn)跨損傷DNA合成(translesionDNA synthesis,TLS)過(guò)程中DNA聚合酶的募集，從而促進(jìn)損傷旁路修復(fù)；PCNA多泛素化(polyubiqui-tinated PCNA)可能參與并促進(jìn)以未受損姐妹單體為模板的損傷回避通路。在植物研究中，擬南芥PCNAl/2兩種亞型在植物細(xì)胞和大腸桿菌中的表達(dá)都存在SUMO化901；而且也發(fā)現(xiàn)，擬南芥PCNA在UBC和RAD5a的作用下可以被泛素化修飾。但目前對(duì)植物PCNA SUMO化和泛素化修飾的生物學(xué)功能尚不清楚。
3 PCNA的功能
3.1 PCNA參與DNA復(fù)制
真核生物DNA復(fù)制為半保留復(fù)制，在多種DNA聚合酶作用下，分別合成前導(dǎo)鏈和后隨鏈。DNA復(fù)制啟動(dòng)后，多種復(fù)制相關(guān)蛋白結(jié)合于復(fù)制起始位點(diǎn)，隨后由DNA解旋酶將雙鏈DNA解旋成單鏈，起始合成RNA引物并延伸。人體外同位素標(biāo)記實(shí)驗(yàn)表明，PCNA在復(fù)制過(guò)程中發(fā)揮重要作用：PCNA結(jié)合在初始合成的DNA上，當(dāng)合成到達(dá)復(fù)制叉處，卸載pola，并且阻止pola再次結(jié)合；與pola結(jié)合，引導(dǎo)前導(dǎo)鏈持續(xù)合成；與pola結(jié)合，合成岡崎片段。在酵母PCNA后隨鏈的合成中，PCNA結(jié)合Fenl與Ligl蛋白122.34。植物中也發(fā)現(xiàn)并驗(yàn)證了PCNA和Fenl的互作，并且PCNA結(jié)合可以增強(qiáng)Fenl活性。目前認(rèn)為，在DNA復(fù)制過(guò)程中，PCNA主要是對(duì)復(fù)制相關(guān)蛋白的穩(wěn)定、招募和動(dòng)態(tài)交換過(guò)程起著非常重要的作用。
跨損傷DNA合成過(guò)程是真核生物通過(guò)特定合成酶類，如pol 1、pol L、pol K、pol∈、Revl，Rev7，以受損傷或錯(cuò)誤DNA為模板復(fù)制DNA鏈。在這一過(guò)程中，PCNA可以與多種TLS特異的聚合酶結(jié)合，也可以特異結(jié)合P21等蛋白，對(duì)聚合酶的作用進(jìn)行調(diào)控。通過(guò)酶活性測(cè)定及酶聯(lián)免疫印跡等實(shí)驗(yàn)分析，哺乳動(dòng)物PCNA單泛素化形成的Ubp-PCNA通過(guò)刺激復(fù)制和TLS的酶類來(lái)刺激TLS。當(dāng)PCNA三聚體的穩(wěn)定性下降時(shí)，會(huì)影響PCNA與聚合酶類的結(jié)合效應(yīng)，影響TLS。PCNA作為T(mén)LS的調(diào)節(jié)因子募集特殊的聚合酶如pol 11，調(diào)節(jié)聚合酶與pol 8和pols之間的相互作用，增強(qiáng)損傷旁路活性。在擬南芥2個(gè)PCNA亞型相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)，因PCNAI和PCNA2的亞基在氨基酸Asn201上存在差異，導(dǎo)致TLS相關(guān)的pol n只能與PCNA2結(jié)合，不與PCNA1結(jié)合。
3.2 PCNA參與DNA修復(fù)
植物細(xì)胞DNA分子不斷受到物理和化學(xué)等因素的影響，導(dǎo)致DNA分子出現(xiàn)斷裂、堿基的化學(xué)修飾或錯(cuò)配。如果不進(jìn)行正確修復(fù)，植物細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育會(huì)受到嚴(yán)重影響。目前，切除修復(fù)( exclsion re-pair,ER)和錯(cuò)配修復(fù)(mismatch repair，MMR)是2條主要途徑。在酵母、人和植物研究中發(fā)現(xiàn)，PCNA涉及到上述2種DNA修復(fù)的功能。
DNA切除修復(fù)途徑包括堿基切除途徑(base-excision repair，BER)和核苷酸切除途徑(nucleo-ticle-excision repalr，NER)。單個(gè)堿基錯(cuò)誤時(shí)以BER方式進(jìn)行修復(fù)，而DNA損傷較嚴(yán)重時(shí)以NER方式進(jìn)行修復(fù)。BER過(guò)程中，首先需要由DNA糖基化酶形成一個(gè)無(wú)嘧啶堿基位點(diǎn)（apyrimidinic site，AP位點(diǎn)），由AP核酸內(nèi)切酶切除磷酸骨架，隨后由PCNA介導(dǎo)的DNA聚合酶8/8修復(fù)通路修復(fù)切口。PCNA在BER中與AP內(nèi)切酶APnl和APn2、尿嘧啶DNA糖基酶1、3-甲基腺嘌呤DNA糖基酶等結(jié)合并發(fā)揮作用，在BER修復(fù)中參與剪切與再合成這2個(gè)關(guān)鍵步驟。NER過(guò)程分為全基因組修復(fù)和轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)的修復(fù)，二者的識(shí)別機(jī)制有所不同。識(shí)別損傷后對(duì)錯(cuò)誤位點(diǎn)進(jìn)行切除，并通過(guò)PCNA結(jié)合pol 8/8、RFC、DNA ligl、Fenl等對(duì)缺口進(jìn)行修復(fù)合成。切除修復(fù)機(jī)制的研究主要集中在酵母和哺乳動(dòng)物中，但近年來(lái)大部分相關(guān)酶類在植物體中也被發(fā)現(xiàn)并得到驗(yàn)證，如胡蘿卜中參與BER的尿嘧啶DNA糖基化酶，擬南芥中得到的參與BER的3-甲基糖基化酶、參與NER的多種相關(guān)蛋白。這些結(jié)果表明，PCNA可能在植物體切除修復(fù)過(guò)程中也發(fā)揮重要作用。此外，Gao等對(duì)西紅柿中一種PCNA同系物DDI2(damagecl DNA bincling protein interact-ing protein 2)進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)DDI2表達(dá)水平將影響紫外線(UV)誘變下的DNA損傷修復(fù)和植物對(duì)UV脅迫的耐受性，在過(guò)表達(dá)DDI2基因的植株中，DNA損傷修復(fù)速度加快，在沉默DDI2基因的植株中，損傷修復(fù)遲緩，表明其在UV誘發(fā)的DNA損傷修復(fù)中有非常重要的作用。
復(fù)制后的DNA為半甲基化狀態(tài)，若發(fā)生錯(cuò)配，須將未甲基化的鏈切除，并以甲基化DNA為模板修復(fù)合成。這一過(guò)程中需要多種MSH( MutS-homolog)復(fù)合體參與位點(diǎn)識(shí)別，以及多種修復(fù)相關(guān)的酶類對(duì)位點(diǎn)進(jìn)行修復(fù)。PCNA在這一過(guò)程中主要參與pol 8／s合成通路，此外還通過(guò)與多種相關(guān)蛋白互作發(fā)揮功能。通過(guò)酵母PCNA點(diǎn)突變株系與提純的人類MSH蛋白互作分析證實(shí)，PCNA可以與MSH3、MSH6蛋白互作，增強(qiáng)其錯(cuò)配位點(diǎn)結(jié)合能力。通過(guò)放射性標(biāo)記和多聚核苷酸激酶標(biāo)記證實(shí)，PCNA可以與MSH2-MSH6結(jié)合形成三元復(fù)合體，促進(jìn)其與發(fā)生錯(cuò)配的未甲基化DNA鏈的結(jié)合，并在ATP作用下轉(zhuǎn)移到錯(cuò)配堿基位點(diǎn)。對(duì)植物中MMR的相關(guān)研究較少，但在擬南芥中得到了MMR修復(fù)必要的MSH2、MSH3、MSH6、MSH7等基因l51.551，表明擬南芥MMR過(guò)程與哺乳動(dòng)物和酵母的MMR過(guò)程是相似的，PCNA可能在植物的該過(guò)程中發(fā)揮作用。
3.3 PCNA參與細(xì)胞周期
細(xì)胞周期是細(xì)胞在周期時(shí)相的不斷變遷中進(jìn)入增殖、分化、衰老和死亡等生理狀態(tài)。在人的相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)PCNA是一種細(xì)胞周期相關(guān)蛋白，其含量在細(xì)胞周期的不同時(shí)期差異明顯。PCNA通過(guò)與幾種真核細(xì)胞周期蛋白互作，如細(xì)胞周期素-CDK復(fù)合體、CDK抑制物P21等，參與細(xì)胞周期調(diào)控。動(dòng)物細(xì)胞中PCNA作為CDK2與其基質(zhì)的連接物，促進(jìn)CDK2對(duì)RFC、DNA ligl等復(fù)制相關(guān)酶類的磷酸化。PCNA結(jié)合于CDK2-細(xì)胞周期蛋白A復(fù)合體，催化pol a／引發(fā)酶復(fù)合體的磷酸化。P21作為一類細(xì)胞周期抑制因子，在衰老或基因組損傷的細(xì)胞中，P21的N端結(jié)合于CDK，C端結(jié)合于PCNA，使其無(wú)法與RFC.pol 8等結(jié)合，通過(guò)抑制相關(guān)酶類的活性來(lái)抑制細(xì)胞周期。對(duì)植物P21同源基因的研究較少，但植物PCNA可以與人的P21蛋白相結(jié)合，表明PCNA在細(xì)胞周期相關(guān)功能中存在保守性。此外，在擬南芥研究中已經(jīng)證實(shí)，PCNA1和PCNA2能夠與細(xì)胞周期蛋白D相互作用，表明PCNA在植物體細(xì)胞周期相關(guān)調(diào)控中發(fā)揮著重要作用。
4結(jié)語(yǔ)
目前，雖然已獲得了幾種植物PCNA基因，并對(duì)其生物學(xué)功能做了一些研究，但許多問(wèn)題還沒(méi)有得到闡明。如PCNA在植物組織或器官的表達(dá)時(shí)空性；擬南芥PCNA的SUMO化和泛素化已經(jīng)得到證實(shí)，但生物學(xué)功能是什么，是否還存在磷酸化、甲基化等其他修飾方式；在植物中獲得的PCNA互作蛋白信息遠(yuǎn)遠(yuǎn)不及酵母和哺乳動(dòng)物細(xì)胞，是否植物中還存在新的相互作用蛋白等等。相信隨著植物基因組學(xué)及功能蛋白質(zhì)組學(xué)研究的深入，可以進(jìn)一步揭示植物PCNA的性質(zhì)及生物學(xué)功能。
