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論文摘要：利用垂直板型聚丙烯酰胺凝膠電泳法（PAGE）對(duì)蟈蟈（Gampsocleis gratisa Brunner Von Wattenwvl）不同發(fā)育期的過(guò)氧化物酶（POD）同工酶進(jìn)行了比較研究。結(jié)果表明，不同發(fā)育階段的蟈蟈，其過(guò)氧化物酶同工酶譜在酶帶數(shù)、遷移率、酶量（酶帶寬窄）及酶活性（酶帶深淺）等方面均存在相似性，但也有一定的差異。以此為基礎(chǔ)，進(jìn)一步探討了過(guò)氧化物酶同工酶在蟈蟈個(gè)體發(fā)育過(guò)程中表達(dá)的相似相異性,為以后蟈蟈的蟲(chóng)態(tài)鑒定及昆蟲(chóng)分類(lèi)提供一定的依據(jù)。
論文關(guān)鍵詞：蟈蟈,過(guò)氧化物酶,同工酶
　　蟈蟈，屬直翅目，螽斯科。其成蟲(chóng)和幼蟲(chóng)可對(duì)農(nóng)作物幼苗造成危害，影響農(nóng)作物生長(zhǎng)發(fā)育，是一種危害型昆蟲(chóng)。但因其美妙動(dòng)聽(tīng)的叫聲，被人們稱為“鄉(xiāng)謠俱樂(lè)部”。蟈蟈是螽斯科中最受大家喜愛(ài)的鳴蟲(chóng)，南方又稱“哥哥”。蟈蟈為漸變態(tài)昆蟲(chóng)，一生要經(jīng)歷卵、若蟲(chóng)、成蟲(chóng)3個(gè)階段。卵多產(chǎn)于植物組織中，或成列產(chǎn)于葉邊緣或莖干上，一般不產(chǎn)在土中，若蟲(chóng)需蛻皮5-6次才能變成成蟲(chóng)。成蟲(chóng)植食性或肉食性，也有雜食種類(lèi)，多棲息于草叢、矮樹(shù)、灌木叢中，善跳躍。雄蟲(chóng)體長(zhǎng)35-38mm，前翅長(zhǎng)14-17mm，雌蟲(chóng)體長(zhǎng)35-52mm，前翅長(zhǎng)6-8mm。體翠綠或黃褐色。觸角長(zhǎng)達(dá)60mm。前胸背板寬大，下緣黃色，胸部腹板各具一對(duì)錐狀突起，后胸的突起最大。足跗節(jié)4節(jié)，第1-3節(jié)有墊，后足第一跗節(jié)跗墊分為兩葉。后足腿節(jié)比脛節(jié)稍長(zhǎng)，脛節(jié)有6個(gè)端距。
　　應(yīng)用同工酶技術(shù)不僅可以鑒別物種，而且可以揭示類(lèi)群的遺傳結(jié)構(gòu)，闡明類(lèi)群的親緣關(guān)系等。
　　過(guò)氧化物酶是一種以過(guò)氧化氫（HO）作為電子受體催化底物的氧化作用的酶，是目前研究較多且較為清楚的氧化酶類(lèi)。它在生物體的不同器官、組織、不同發(fā)育時(shí)期以及不同的代謝條件下普遍存在。在動(dòng)物體內(nèi)，不同發(fā)育時(shí)期過(guò)氧化物酶的種類(lèi)和活性都有差別。由于過(guò)氧化物酶同工酶亦是基因表達(dá)的產(chǎn)物，通過(guò)對(duì)其酶譜的分析能夠比較直接地判斷基因的存在及其表達(dá)規(guī)律，因而可以從分子水平上揭示物種的遺傳基礎(chǔ)，這一點(diǎn)在品種的鑒定、起源、進(jìn)化和分類(lèi)等方面已有諸多應(yīng)用。
　　本試驗(yàn)采用垂直板型聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)（PAGE）對(duì)蟈蟈的卵﹑幼蟲(chóng)和成蟲(chóng)的過(guò)氧化物酶同工酶進(jìn)行分析研究，初步確定各發(fā)育期內(nèi)過(guò)氧化物酶的種類(lèi)和活性，以期為今后蟈蟈的蟲(chóng)態(tài)鑒定和各發(fā)育期內(nèi)的生理變化研究提供一定的依據(jù)。
　　1材料和方法
　　1.1實(shí)驗(yàn)材料
　　本實(shí)驗(yàn)以蟈蟈的卵、不同發(fā)育期的幼蟲(chóng)和成蟲(chóng)為實(shí)驗(yàn)材料，材料均由河北科技師范學(xué)院農(nóng)學(xué)系植物保護(hù)實(shí)驗(yàn)室提供，如表1所示。
　　表1蟈蟈不同發(fā)育期的材料
　　序號(hào)12345678910
　　發(fā)育期卵1齡幼蟲(chóng)2齡幼蟲(chóng)3齡幼蟲(chóng)4齡雄幼蟲(chóng)4齡雌幼蟲(chóng)5齡雄幼蟲(chóng)5齡雌幼蟲(chóng)雄成蟲(chóng)雌成蟲(chóng)
　　1.2試劑
　　分離膠緩沖液、分離膠貯液、濃縮膠緩沖液、濃縮膠貯液、0.14％過(guò)硫酸銨、40％蔗糖、核黃素、乙二胺四乙酸（TEMED）、Tris-Gly電極緩沖液（pH8.3）、0.1％溴酚藍(lán)、過(guò)氧化物酶顯色劑等。
　　1.3儀器
　　GL-20G-Ⅱ型高速冰凍離心機(jī)、RXZ型智能人工氣候箱、層析冷柜、電子天平（千分之一，萬(wàn)分之一）、DYY-Ⅲ型直流穩(wěn)壓電泳儀、24A型垂直板電泳槽、微量進(jìn)樣器（50、100μL）、移液槍、燒杯等。
　　1.4方法
　　1.4.1樣品的制備將卵、幼蟲(chóng)和成蟲(chóng)按照1:2的比例加入0.01M磷酸緩沖液（pH7.4），冰浴研磨。將勻漿轉(zhuǎn)入離心管中，4℃、10000rpm離心5min，取上清液保存于冰箱中備用。
　　1.4.2凝膠制備凝膠的制備根據(jù)文獻(xiàn)[8]的方法進(jìn)行設(shè)計(jì)，略有改動(dòng)（主要是配藥數(shù)據(jù)的改動(dòng)）。
　　1.4.2.1分離膠制備按表2比例配制分離膠。
　　表2分離膠制備
　　貯液名稱分離膠緩沖液分離膠貯液過(guò)硫酸銨水
　　體積比例1241
　　雙面槽用量（ml）918367
　　1.4.2.2隔層膠制備按表3配制隔層膠溶液。
　　表3隔層膠制備
　　貯液名稱濃縮膠緩沖液濃縮膠貯液核黃素40%蔗糖
　　體積比例1412
　　雙面槽用量（ml）41648
　　1.4.3電泳采用垂直板型聚丙烯酰胺凝膠電泳法。每槽加樣量為30μL。于層析冷柜（4℃）中電泳。電泳電壓為200V，電流為30mA。電泳全過(guò)程約為5h。
　　1.4.4染色過(guò)氧化物酶同工酶染色用醋酸-聯(lián)苯胺法，染色時(shí)間依酶帶顯現(xiàn)程度而定。隨后倒出染液，用蒸餾水漂洗三次。脫色后拍照，畫(huà)圖。求出各譜帶的遷移率Rf（Rf=酶帶移動(dòng)距離/指示劑移動(dòng)距離）。
　　2結(jié)果與分析
　　2.1過(guò)氧化物酶同工酶酶譜的分析
　　根據(jù)凝膠電泳顯示的過(guò)氧化物酶同工酶酶譜（圖1）繪制模式圖（圖2）。酶帶深淺表示酶活性大小，酶帶寬窄表示酶量多少。各酶帶遷移率如表1所示。
　　
　　圖1蟈蟈不同發(fā)育期過(guò)氧化物酶同工酶酶譜
　　深較深較淺淺
　　深較深較淺淺
　　
　　圖2蟈蟈不同發(fā)育期過(guò)氧化物酶同工酶酶譜模式圖
　　蟈蟈各個(gè)蟲(chóng)態(tài)的過(guò)氧化物酶同工酶酶譜中，遷移率Rf在0.02-0.45之間。
　　蟈蟈的卵有3條酶帶；1、2齡幼蟲(chóng)分別有10條酶帶；3齡幼蟲(chóng)有9條酶帶；4齡幼蟲(chóng)有11條酶帶；5齡幼蟲(chóng)有9條酶帶；雄成蟲(chóng)和雌成蟲(chóng)分別有7條酶帶。
　　蟈蟈的卵期只有3條酶帶，且顏色淺，活性弱，說(shuō)明在卵期蟈蟈體內(nèi)的過(guò)氧化物酶同工酶含量少且作用不大。蟈蟈從幼蟲(chóng)到成蟲(chóng)期間，酶帶數(shù)目變化不大，說(shuō)明過(guò)氧化物酶同工酶在蟈蟈體內(nèi)長(zhǎng)期存在。而在這其中，蟈蟈1齡和2齡幼蟲(chóng)的酶帶基本相似，說(shuō)明過(guò)氧化物酶同工酶在這兩個(gè)蟲(chóng)態(tài)中含量沒(méi)有變化，即在這兩個(gè)蟲(chóng)態(tài)中所起的作用相同。