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論文摘要：凍害是指零下低溫對(duì)植物造成的傷害。由于全球氣溫上升，極端溫度出現(xiàn)的頻率增加引起農(nóng)業(yè)凍害的發(fā)生，例如北方春季倒春寒，南方冬季出現(xiàn)的凍雨嚴(yán)重地抑制了農(nóng)作物的生長，甚至顆粒無收。提高作物的抗凍性以維持農(nóng)業(yè)的可持續(xù)性發(fā)展是植物育種學(xué)家面臨的重大課題。為了能更有效加快作物抗凍育種工作以利于我國形成穩(wěn)定農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，本文中就近年來國內(nèi)外農(nóng)作物在抗凍基因，抗凍蛋白，以及抗凍生理生化機(jī)制研究進(jìn)展方面作一較為系統(tǒng)的論述，從而為利用基因工程手段進(jìn)行作物抗凍育種及有關(guān)生理的研究提供啟示。
論文關(guān)鍵詞：農(nóng)作物抗凍性,抗凍基因,抗凍蛋白,生理生化變化
　　植物為抵抗冰點(diǎn)以下的低溫使植物組織內(nèi)結(jié)冰引起的傷害稱為凍害。低溫凍害是農(nóng)作物減產(chǎn)的重要因素，全球每年因低溫寒害造成許多農(nóng)作物的損失高達(dá)數(shù)千億美元。研究并提高作物抗凍能力，培育出抗凍作物品種在增加作物抵御驟然低溫能力，維護(hù)作物產(chǎn)量，維持農(nóng)業(yè)的持續(xù)發(fā)展顯得非常重要。因此，作物抗凍性研究具有著重要的科學(xué)理論意義和應(yīng)用價(jià)值。長期以來，人們從植物生理學(xué)、遺傳育種學(xué)、形態(tài)學(xué)、生物化學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)及分子生物學(xué)等多方面對(duì)植物抗凍機(jī)理進(jìn)行了廣泛的研究。近年來，隨著對(duì)抗凍機(jī)理的認(rèn)識(shí)不斷加深，分子生物學(xué)及生物化學(xué)技術(shù)的發(fā)展與滲透，有關(guān)低溫誘導(dǎo)特異蛋白質(zhì)及其相關(guān)基因的克隆、應(yīng)用與作物抗凍性關(guān)系方面已取得了突破性進(jìn)展。本文就作物對(duì)低溫脅迫的抗凍基因、抗凍蛋白、生理生化變化等方面的研究進(jìn)展作一概述，從而為利用基因工程手段進(jìn)行植物抗凍育種及有關(guān)生理的研究提供了新的啟示，也為作物增產(chǎn)提供理論依據(jù)。
　　1與作物抗凍相關(guān)的抗凍基因
　　1.1COR基因表達(dá)提高農(nóng)作物的抗凍性
　　已知的抗凍基因很多，但是目前農(nóng)業(yè)上研究較多的是COR(Cold–regulated)冷誘導(dǎo)基因，如COR15a、COR78、COR6.6、COR47等，對(duì)COR15a基因研究比較深入。Artus等對(duì)擬南芥COR15a基因的研究為冷誘導(dǎo)基因的抗凍作用首次提供了直接的證據(jù)。該研究發(fā)現(xiàn)，未經(jīng)低溫鍛煉的轉(zhuǎn)基因擬南芥植株中COR15a的表達(dá)可使葉綠體的耐凍性增強(qiáng)，其耐受的低溫限度從-2～-4C增加到了-5～-8C。為了進(jìn)一步鑒定COR15a基因的調(diào)控機(jī)理，Artus等用CaCl和緩沖液洗過的樣品放入試管，然后加入酒精在-2C冰浴15分鐘，試管外形成冰的懸浮，再經(jīng)30分鐘等溫處理后，樣品以每分鐘0.8C速度下降。在此過程中，用雙醋酸熒光素染色檢查原生質(zhì)體質(zhì)膜的半通透性。結(jié)果顯示COR15a基因表達(dá)的原生質(zhì)體膜半通透性明顯低于未轉(zhuǎn)基因型植株，這表明COR15a的表達(dá)對(duì)膜起保護(hù)和穩(wěn)定作用。低溫對(duì)細(xì)胞膜的損傷主要原因是由于冰凍引起的細(xì)胞脫水而導(dǎo)致膜的脂雙層向六角形II相轉(zhuǎn)變以及膜的破裂，而COR15a的表達(dá)增強(qiáng)可減少質(zhì)膜遇低溫時(shí)所產(chǎn)生的由脂雙層向六角形II相轉(zhuǎn)變的機(jī)率。研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，COR15a通過降低了二油磷脂酰乙醇胺向六角形II轉(zhuǎn)相變的溫度，并改變?nèi)~綠體被膜內(nèi)膜的彎曲性，從而減少對(duì)膜的傷害。減少膜的傷害可使植株存活率提高，Puhakaine等用電擊法通過農(nóng)桿菌pGV2260，將COR15a基因侵染擬南芥。研究發(fā)現(xiàn)，低溫條件下，轉(zhuǎn)基因擬南芥植株比對(duì)照植株降低了LT5，并且轉(zhuǎn)基因植株的存活率也明顯高于對(duì)照植株。但也有特殊，Jaglo-Ottosen的研究發(fā)現(xiàn)，雖然COR15a轉(zhuǎn)基因擬南芥的抗凍性提高了，但植株的抗凍力提高并不顯著。他們認(rèn)為，這可能由于單個(gè)COR15a基因不足以明顯提高植株的抗凍能力，植物的抗凍性是由多基因共同作用的效果。
　　COR其它基因的表達(dá)也能增強(qiáng)抗凍性。前人研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因的馬鈴薯沒有低溫刺激由于CBF過表達(dá)誘導(dǎo)COR表達(dá)使脯氨酸和總含糖量增加而增強(qiáng)植株抗凍性。COR19轉(zhuǎn)入煙草，和對(duì)照煙草植株相比較，轉(zhuǎn)基因植株電滲值較低、發(fā)芽率較高、抗凍性有所提高。對(duì)小麥低溫處理，在20C生長4周后，每?jī)商旖档?C，降到12C達(dá)到COR14b最佳水平，這表明低溫誘導(dǎo)小麥COR14b水平升高使抗凍性增加。
　　1.2CRT/DRE調(diào)節(jié)誘導(dǎo)增強(qiáng)農(nóng)作物抗凍性
　　從轉(zhuǎn)基因的擬南芥中發(fā)現(xiàn)，由于CBF1/DREB1b或CBF3/DREB1a基因的超表達(dá)，使上述含有CRT/DRE調(diào)節(jié)元件的冷相關(guān)基因能在正常溫度環(huán)境中表達(dá)，這種含有CRT/DRE調(diào)控元件并由CBF/DREB1轉(zhuǎn)錄活化因子誘導(dǎo)表達(dá)的基因稱為CBF調(diào)控元件。Stockinger等首次分離了結(jié)合CRT/DRE序列的蛋白質(zhì)的cDNA，分子量為24kD,具有兩組分的核定位序列和作為激活結(jié)構(gòu)域的酸性區(qū)域。CRT/DRE調(diào)節(jié)元件相互作用，調(diào)節(jié)啟動(dòng)子區(qū)域含該順式作用元件的基因的表達(dá)，主要在低溫和短日照下啟動(dòng)表達(dá)，使細(xì)胞表現(xiàn)出抗冷能力。Gilmour等研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥暴露在低溫下，迅速誘導(dǎo)CBF目的基因表達(dá)，CBF調(diào)節(jié)子CRT/DRE致使植物抗凍性增強(qiáng)，用Northernblot分析證明，CBF調(diào)節(jié)子由COR基因和該基因啟動(dòng)子中的CRT/DRE順式作用元件共同組成。低溫時(shí)ICE被激活，激活的ICE能特異地結(jié)合到CBFs基因的啟動(dòng)子上，誘導(dǎo)CBF/OREB1基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生CBF/DREB1，進(jìn)一步作用于COR基因的啟動(dòng)子內(nèi)CRT/DRE順式作用元件，使低溫應(yīng)答基因開始轉(zhuǎn)錄、表達(dá)，從而使植物產(chǎn)生抗寒性。
　　1.3CBF表達(dá)增強(qiáng)農(nóng)作物冷凍適應(yīng)性
　　CBF(C-repeat-bindingfactors)基因家族是一個(gè)包括CBF1、CBF2、CBF3、CBF4的小基因家族，其成員在植物抗寒、抗旱及抗鹽堿方面起著很大的作用。