土壤和水樣中阿特拉津的微生物降解研究
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李明銳， 陳建軍， 湛方棟， 李元， 祖艷群
（云南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，云南 昆明650201）
摘要：利用實驗室已經(jīng)篩選到的阿特拉滓降解菌株Arthrobacter sp．FM326為研究材料，研究了該降解菌在不同含水率(5%、15%、25%)的土壤和不同的水樣中（農(nóng)藥廠排污水水樣、晉寧蔬菜地溝渠水樣、盤龍江水樣）對阿特拉津的降解。實驗結(jié)果表明，培養(yǎng)3d后，菌株FM326顯著促進了污染土壤巾阿特拉津的降解（降解效率可達95%）。土壤含水率較低時，土壤中阿特拉津的降解作用主要靠微生物的作用。隨著土壤含水率的增加，土壤中阿特拉津的物理化學(xué)降解作用增強，但仍以生物降解作用為主。培養(yǎng)5 d后，與對照相比，菌株FM326在3種水樣中對阿特拉津均有顯著的降解作用，其降解效率由大到小的順序為：農(nóng)藥廠排污水水樣(98%)>晉寧蔬菜地溝渠水樣(91%)>盤龍江水樣(86%)。
關(guān)鍵詞：Arthrobacter sp．FM326; 阿特拉津；降解；微生物修復(fù)；土壤
阿特拉津（化學(xué)名稱是2-氯-4-乙氨基-6-異丙氨基一1，3，5三嗪）是一種世界范圍內(nèi)廣泛使用的除草劑，常用于甘蔗、玉米等農(nóng)作物防除雜草。由于長期大量使用阿特拉津，且阿特拉津在環(huán)境中的半衰期較長，導(dǎo)致阿特拉津易殘留在土壤和水環(huán)境中，或者進入食物鏈，進而給生態(tài)環(huán)境帶來污染，給人類健康造成危害，是一種長期的潛在威脅，因此引起世界各國學(xué)者的廣泛關(guān)注。
修復(fù)環(huán)境阿特拉津污染的方法有物理、化學(xué)和生物降解，由于阿特拉津降解的最主要機制是生物降解，而且生物降解有成本低、高效、無二次污染和操作簡單等優(yōu)點而成為研究的焦點。為了進行阿特拉津污染土壤的微生物修復(fù)，人們篩選出了大量的阿特拉津降解菌。本實驗室也獲得了阿特拉津降解菌Arthrobacter sp. FM326，該節(jié)桿菌能以阿特拉津為唯一的碳源和氮源生長，培養(yǎng)96 h后對1 000 mg/L阿特拉津降解效率達到97%。
微生物強化修復(fù)是修復(fù)農(nóng)藥污染土壤的主要方式，向環(huán)境中投加特定微生物分解污染物，修復(fù)被農(nóng)藥污染的環(huán)境。把具有降解能力的菌株投加入土壤中后，確實顯著提高了阿特拉津的降解效率，發(fā)揮了修復(fù)污染的作用。Struthers等將分離到的Agrobacterium radiobacter J14a接種到受阿特拉津污染的土壤中，使阿特拉津的礦化速度提高2—5倍。Lima等將Pseudomonas ADP菌株與生物刺激（加入檸檬酸鈉）結(jié)合起來，對污染土壤（60 mg/kg）修復(fù)1周，最終去除了98%的阿特拉津。劉春光等把Arthrobacter T3ABl接種到阿特拉津污染土壤中，試驗證明菌株對后茬敏感作物水稻的各項生長指標(biāo)（出苗率、株高、株鮮重等）能夠起到很好的改善作用。
不同的降解菌株接種在土壤中，對阿特拉津的降解效果是不相同的，有些菌株可以迅速發(fā)揮作用，有些菌株會出現(xiàn)延滯。因為環(huán)境介質(zhì)條件非常復(fù)雜，同時農(nóng)藥在自然環(huán)境中復(fù)雜的物理、化學(xué)反應(yīng)及生物學(xué)變化，菌株的實際降解能力和效果不穩(wěn)定，所以培養(yǎng)基中所反映出來的效果代表不了菌株在實際生態(tài)環(huán)境中的修復(fù)效果，因此還需要通過在實際環(huán)境介質(zhì)中進行驗證。
本文研究了實驗室條件下降解菌FM326在不同含水率土壤中和不同水樣（農(nóng)藥廠排污水、蔬菜地溝渠水和盤龍江水）中對阿特拉津的降解效果，為該菌株的進一步研究及修復(fù)環(huán)境中阿特拉津的污染提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐。
1材料與方法
1.1材料
供試菌株：從昆明農(nóng)藥廠富民分廠土壤樣品中分離而得的節(jié)桿菌屬細菌FM326。
阿特拉津原藥：純度98%，山東濱農(nóng)科技有限公司生產(chǎn)（由昆明農(nóng)藥廠富民分廠提供）。
1.2 土樣的采集和制備
2012年5月4日，5點法布點采樣，采集云南農(nóng)業(yè)大學(xué)教學(xué)基地玉米田的土壤，除去土壤表面的雜草和枯枝落葉，采樣深度約為20 cm。將所采樣品等量均勻混合，自然風(fēng)干，過20目篩，測定得土壤pH值為6.5，含水率為4.18%，全氮值為1.56 g/kg。土樣中未檢測出阿特拉津。
1.3水樣采集方法及水樣簡介
1.3.1水樣采集方法
提前準備好干凈的礦泉水瓶或飲料瓶，直接用清洗干凈的礦泉水瓶在5點分別采集1個水樣，并將所采樣點的水樣混合。水樣取回后迅速放冰箱4℃保存。水樣的理化性質(zhì)見表1。
1.3.2水樣采樣地
本實驗采集了農(nóng)藥廠排污水水樣、晉寧蔬菜地溝渠水樣和盤龍江水樣。農(nóng)藥廠排污水長期受農(nóng)藥的污染，水體的理化性質(zhì)及其微生物組成必將受到影響。晉寧蔬菜地溝渠水是從蔬菜地里排出的水，水中雜物多，總不可濾殘渣含量大，有機質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)含量高，氨氮含量高。蔬菜地施用農(nóng)藥的種類和數(shù)量也較多。盤龍江源于昆明市北郊，而后由北向南縱穿昆明城而過，主要受到居民生活的污染，水樣中含有大量氮、磷元素，具有生活污水的典型代表性。水樣中均未檢測出阿特拉津。
1.4 FM326菌株在土壤中對阿特拉津的降解試驗
選取180個廣口罐頭瓶，稱重記錄。稱取制備好的土壤，按50.0 g／杯的量分裝到廣口罐頭瓶中，用一層布把口封起來。取其中90個罐頭瓶滅菌（密封罐頭瓶放入蒸汽高壓滅菌鍋中，121℃滅菌25 min），另外90個不滅菌。稱取0.5 g阿特拉津原藥，溶于少量丙酮中，再加入純水，使阿特拉津分散均勻，定容到2L，得到阿特拉津濃度為250 yg/mL的懸濁液。吸取10 mL阿特拉津懸濁液，均勻施人土壤中，使土壤中阿特拉津濃度為50 p-g/g土。吸附24 h備用。
共進行4個處理，分別是：不滅菌不加菌( NSNA)、滅菌不加菌(SNA)、不滅菌加菌(NSA)、滅菌加菌(SA)。加菌處理組接人OD600值為l的菌懸液10 mL，根據(jù)土壤和罐頭瓶的重量，調(diào)整土壤的含水量分別為5%、15%和25%，置于30℃培養(yǎng)箱中保溫保濕培養(yǎng)，每天稱瓶子和土壤的重量，保持土壤的含水量。分別在培養(yǎng)的第0天、3天、6天、9天、12天從培養(yǎng)箱中取出12個罐頭瓶（4個處理，每個處理3個重復(fù)），提取土壤中的阿特拉津。
土壤樣品中阿特拉津的提取：從樣品中稱取10 g土樣于150 mL三角瓶，加入20 mL甲醇（分析純），放在搖床上振蕩30 min，轉(zhuǎn)入離心管，在轉(zhuǎn)速4 000 r/min離心8 min，上層清液用0.22um有機系濾膜過濾，將濾出液放在0℃下冷藏待測。
1.5降解茵在水樣中對阿特拉津的降解試驗
調(diào)整供試水樣pH為7.0。將水樣分裝于250 mL三角瓶中，每瓶100 mL，加入阿特拉津，使每瓶的阿特拉津含量為100 mg/L。在每瓶中加入1 mL FM326的菌懸液，菌懸液的制備見李明銳等。共進行4個處理，分別是：不滅菌不加菌( NSNA)、滅菌不加菌(SNA)、不滅菌加菌(NSA)、滅菌加菌(SA)，每個處理3個重復(fù)，共48瓶。滅菌的水樣裝入250 mL的三角瓶中，用一層布和一層牛皮紙封口后，放人蒸汽高壓滅菌鍋中滅菌（121℃滅菌25 min）。隨后放置在30℃恒溫搖床上120 r/min震蕩培養(yǎng)，分別在Oh、24 h、72 h、120 h定時取3個重復(fù)，用0.22 ym有機系濾膜過濾培養(yǎng)液，收集濾液，待測。
1.6高效液相色譜法測定樣品中阿特拉津含量
用高效液相色譜（安捷倫1200液相色譜儀，紫外可見檢測器；色譜柱：18C反相硅膠色譜柱，10 yL微量進樣器）檢測濾液中的阿特拉津，同時以阿特拉津標(biāo)準樣品為對照。阿特拉津測定條件：甲醇：水=80:20，柱溫25℃，波長222 nm，流速1 mL/min，保留時間2.3 min。
1.7 實驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計軟件和統(tǒng)計方法
數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析軟件使用IBM SPSS Statistics21.0，使用單因素方差分析(ANOVA)，多重比較使用最小顯著差數(shù)法(LSD)。
2結(jié)果與分析
2.1 降解菌FM326對土壤中阿特拉津的降解
2 .1.1含水量5%的土壤中FM326對阿特拉津的降解
在土壤的含水量是5%的土壤中，隨著培養(yǎng)時間的增加，4種處理的阿特拉津含量均顯著的降低(圖1)。加菌的2個處理比沒有加菌的2個處理的阿特拉津含量降低的速度更快。
不滅菌不加菌( NSNA)這個處理中，阿特拉津的降解主要是其在土壤中的物理化學(xué)或者光降解和土著微生物的降解組成；滅菌不加菌(SNA)這個處理中，阿特拉津的降解主要是其在土壤中的物理化學(xué)或者光降解。在培養(yǎng)的過程中，這2個處理的阿特拉津殘留量只有在第9天的時候有顯著的差異，其它時間都達不到顯著差異，這說明在土壤的含水量是5%時，土壤中的土著微生物對阿特拉津的降解幾乎不起作用，阿特拉津的降解主要是物理化學(xué)或者光降解等自然降解。
在不滅菌加菌(NSA)這個處理中，阿特拉津的殘留量迅速下降，在第3天已經(jīng)降解了95%。在滅菌加菌(SA)這個處理中，阿特拉津的降解相對緩慢，但在第6天時降解效率達到96%。比較2個處理得知，在不滅菌加菌這個處理中，阿特拉津迅速降解，除了添加菌株起到降解的作用，土著微生物也起到了協(xié)同作用；在滅菌加菌這個處理中，加入的降解菌株首先需要適應(yīng)土壤的生存環(huán)境，再進行生長繁殖從而降解阿特拉津，因此降解過程相對緩慢。
培養(yǎng)到試驗結(jié)束的時候(12 d)，進行了生物強化（額外添加降解菌）的2個處理，阿特拉津的殘留量極顯著(p<0.01)的低于沒有進行生物強化的2個處理（沒有額外添加降解菌）。這充分證明了FM326作為生物強化的菌種降解阿特拉津是可行的。
2 .1.2含水量15%的土壤中FM326對阿特拉津的降解
在土壤含水量為15%時，4個處理的阿特拉津的殘留量隨著培養(yǎng)時間的增加而顯著降低，見圖2。
不滅菌加菌和滅菌加菌這2個處理比較，在培養(yǎng)開始時(0 d)，由于實驗誤差，不滅菌加菌這一處理的阿特拉津提取量就顯著的高于滅菌加菌的處理。但是可能由于土壤水分比較適宜降解菌的生長繁殖，在培養(yǎng)的第3天，兩個處理的阿特拉津殘留量就基本持平。隨后的培養(yǎng)時間里，由于阿特拉津降解菌繼續(xù)保持較強的降解能力，滅菌加菌這一處理的阿特拉津殘留量都是幾個處理中最低的。說明在土壤15%的含水量條件下，阿特拉津降解菌的降解能力旺盛，相比較而言，土著微生物的活性可以忽略不計，甚至由于它和降解菌在生存方面的競爭，在一定程度上阻礙了降解菌的降解。
2 .1.3含水量25%的土壤中FM326對阿特拉津的降解
25%的含水量接近土壤的飽和含水量，從圖3可以看出，阿特拉津的降解仍以生物降解為主。
在土壤的含水量是25%時，試驗提取測定的阿特拉津殘留量的數(shù)據(jù)波動性較大。2個沒有進行生物強化的處理（NSNA和SNA），在培養(yǎng)的前9d，阿特拉津的殘留量沒有發(fā)生顯著的變化，培養(yǎng)到第12天時，阿特拉津的殘留量顯著降低。與土壤含水量為5%(圖1)和15%(圖2)時的2個相同處理比較，阿特拉津的殘留量有隨著土壤含水量的增加而顯著降低的趨勢，說明隨土壤含水量增加，阿特拉津在土壤中的物理化學(xué)降解作用逐漸增強。
進行了生物強化的2個處理（NSA和NA），阿特拉津的殘留量在培養(yǎng)的前6d降低不顯著，從培養(yǎng)的第9天開始，阿特拉津的殘留量顯著降低。在培養(yǎng)結(jié)束時，4個處理的阿特拉津含量沒有顯著差異，這說明在25%的飽和含水量，土壤中阿特拉津的物理化學(xué)降解能力很強，但仍以生物降解為主。
2.2 降解茵FM326對水樣中阿特拉津的降解
2.2.1農(nóng)藥廠排污水水樣中FM326對阿特拉津的降解
圖4可以看出，4種處理的阿特拉津含量隨著培養(yǎng)時間的增加而顯著降低，加菌的2個處理的阿特拉津含量在培養(yǎng)的過程中顯著的低于不加菌的2個處理。培養(yǎng)ld的時候，添加降解菌的2個處理，水樣中阿特拉津的降解效率分別是77%(NSA)和79%( SA)，顯著高于不添加降解菌的2個處理。到培養(yǎng)的5d的時候，添加降解菌的2個處理，水樣中阿特拉津的降解效率分別是95%(NSA)和98%( SA)。試驗結(jié)果證明了降解菌在阿特拉津降解過程中起到了重要的作用。沒有添加降解菌的2個處理，培養(yǎng)結(jié)束時水樣中阿特拉津的降解效率分別是21%(NSNA)和8.3%( SNA)。這2個處理的降解可能是阿特拉津在培養(yǎng)的過程中，發(fā)生了物理化學(xué)分解和光降解的損失量，以及污染水體中土著微生物的作用。
2.2.2蔬菜地溝渠水中FM326對阿特拉津的降解
在晉寧蔬菜地溝渠水樣中，在培養(yǎng)的過程中(圖5)，額外加菌的2個處理（NSA和SA）阿特拉津含量在培養(yǎng)結(jié)束時顯著降低，阿特拉津的殘留量分別是6.35 mg/L(不滅菌)和6.47 mg/L(不滅菌)。在培養(yǎng)的第1天，不滅菌加菌的阿特拉津含量顯著的高于滅菌加菌，可能是因為在不滅菌的水中加入降解菌后，水樣中的土著微生物沒有協(xié)助阿特拉津的降解，相反與降解菌的生長、繁殖和對營養(yǎng)的獲得有一個競爭和適應(yīng)的階段，導(dǎo)致降解菌降解能力有一個延緩階段。
NSNA和SAN這2個處理的阿特拉津含量在培養(yǎng)的過程達不到顯著差異，說明在這樣的蔬菜地溝渠水體中，水體的理化特性決定了阿特拉津的物理化學(xué)降解和土著微生物的降解很小，幾乎可以忽略不及。
2.2.3盤龍江水中FM326對阿特拉津的降解
在盤龍江水樣中（圖6），4個處理的阿特拉津含量隨著時間的增加均顯著降低，但是加菌這2個處理的阿特拉津含量顯著的比不加菌的2個處理降解的多。
培養(yǎng)結(jié)束時(5 d)，額外添加降解菌的阿特拉津殘留量是10.36 mg/L(不滅菌)和31.46 mg/L(滅菌)。前者的降解能力顯著高于后者，說明盤龍江水樣中的土著微生物在阿特拉津的降解過程中起到了極大的協(xié)同作用。
3討論
許多研究證實，微生物強化作用可以降解環(huán)境中的阿特拉津。Aislabie等向10 g土壤中加入阿特拉津和西瑪津，接種Arthrobacter降解菌確實提高了阿特拉津和西瑪津的降解。鄭柳柳等巴Arthrobactersp. AD30和Pseudomonas sp．AD39的混合菌液接種阿特拉津濃度為176 mg/L的工業(yè)廢水，30℃振蕩培養(yǎng)72 h以后，99.1%的阿特拉津被去除。土壤中的阿特拉津污染較輕時，用生物強化就可以快速降解阿特拉津；當(dāng)土壤中的阿特拉津污染較嚴重時，生物強化和生物刺激共同作用來降解土壤中的阿特拉津。本文中，把FM326加入到土壤和水中，顯著提高了阿特拉津降解效率，起到了對污染環(huán)境介質(zhì)的修復(fù)作用。
然而，使用活的微生物進行生物修復(fù)存在許多局限，例如，土壤中的水分含量、土壤類型和土壤質(zhì)地、阿特拉津施用年限、土壤pH值、缺乏養(yǎng)分、土壤中微生物群落的組成和數(shù)量大小、有毒物質(zhì)和鹽分等，這些因素影響微生物的生存或者降解速率。
在本實驗中，不同含水量影響了阿特拉津在土壤中的降解過程．不同性質(zhì)的水樣影響了阿特拉津在水中的降解。培養(yǎng)結(jié)束時，在5%、15%和25%的含水量土壤中，阿特拉津的殘留量分別是20.5—23.6u g /g、14.4~22.8 u g /g和3.7—6.5 u g /g。這說明，隨著土壤濕度的增加，阿特拉津的降解就越徹底。代先祝等研究表明，菌株Arthrobacter sp．AG1降解完土壤中的阿特拉津后，在土壤含水量分別為5%和15%的情況下能長期保持降解活性，對60 d后第2次施入黃棕壤和潮土中的50 mg/kg阿特拉津4d時降解效率在65%以上。土壤中水分含量對降解效果影響較大，>20%時降解效果較好，這與本實驗得到的結(jié)論相一致。
把活的微生物接種到實際的環(huán)境中，受到上述環(huán)境因素的影響，使得生物強化在實際應(yīng)用中容易失敗。近年來，如何把微生物固定起來進行實際環(huán)境的污染治理成為人們關(guān)注的焦點。
4結(jié)論
(1)利用降解菌FM326進行生物強化處理，可以顯著的促進土壤和水樣中阿特拉津的降解。土壤中培養(yǎng)3d后，降解效率可達95%;水樣中培養(yǎng)5d后，降解效率可達98%。
(2)菌株FM326在土壤中降解阿特拉津時，受到土壤含水率的影響。在土壤含水率為15%時，菌株的降解能力最顯著。
(3)不同的水樣，因其不同的土著微生物和物理化學(xué)特性，顯著地影響著FM326對阿特拉津的降解。
