鄱陽湖灰化苔草浸泡液對(duì)銅綠微囊藻的化感作用
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李林， 陳峰， 趙榮芳，
（1．江西師范大學(xué)鄱陽湖濕地與流域研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西南昌330022;
2．江西省水利規(guī)劃設(shè)計(jì)院，江西南昌 330029）
摘要：在室內(nèi)控溫、控光條件下，研究鄱陽湖洲灘優(yōu)勢(shì)植物灰化苔草浸泡液對(duì)銅綠微囊藻生長的影響。試驗(yàn)得到，灰化苔草浸泡液對(duì)銅綠微囊藻的抑制作用較高；枯灰化苔草浸泡液對(duì)銅綠微囊藻的抑制率在81‰88%，隨浸泡液植物生物量含量的增加而增加，當(dāng)浸泡液植物生物量含量大于24 g/L后對(duì)銅綠微囊藻抑制率差異較�。货r灰化苔草浸泡液對(duì)銅綠微囊藻的抑制率大于90%，浸泡液植物生物量含量超過6 g/L時(shí)，對(duì)銅綠微囊藻抑制率差異較��；灰化苔草浸泡液巾化感物質(zhì)使微囊藻細(xì)胞直徑較對(duì)照組減小8%~12%，藻細(xì)胞發(fā)生固縮現(xiàn)象；微囊藻細(xì)胞超氧化物歧化酶(SOD)活性在0.57—1.14 U/106 cell之間占對(duì)照組的30%~60%，藻細(xì)胞內(nèi)氧化活性降低，胞內(nèi)過氧化氫物不能及時(shí)去除在胞內(nèi)積累，單位藻細(xì)胞丙二醛(MDA)增加3—4倍，藻細(xì)胞膜脂過氧化使藻細(xì)胞生長受到抑制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果得到鄱陽湖洲灘優(yōu)勢(shì)植物灰化苔草在夏季將對(duì)藍(lán)藻水華產(chǎn)生抑制作用，這為開發(fā)和利用鄱陽湖岸灘優(yōu)勢(shì)植物苔草生態(tài)控藻提供基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。
關(guān)鍵詞：灰化苔草；銅綠微囊藻；浸泡液；化感抑藻
富營養(yǎng)化引起的藍(lán)藻水華已成為全球性的環(huán)境問題，隨著全球人口增加和需水量增加，藍(lán)藻水華導(dǎo)致水體生物化學(xué)性質(zhì)發(fā)生改變和水體功能下降。全世界平均約有59%的水華有毒，在我國大部分富營養(yǎng)化水體中藍(lán)藻水華主要以銅綠微囊藻有優(yōu)勢(shì)藻種，對(duì)環(huán)境和社會(huì)經(jīng)濟(jì)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，有效防止藍(lán)藻水華發(fā)生是迫切需要解決的問題。藍(lán)藻水華的治理方法主要包括物理、化學(xué)和生物等方法，容易產(chǎn)生二次污染，處理成本高，很難用于天然水體藍(lán)藻水華的治理。Molich等提出植物化感抑藻，化感抑藻是一種新型的有效的控制藍(lán)藻水華，植物化感抑藻具有綠色、低成本、化感物質(zhì)容易獲得、熱穩(wěn)定性高和無二次污染等優(yōu)點(diǎn)，在應(yīng)用上具有很好的發(fā)展前景。
植物化感抑藻受到廣泛的關(guān)注，研究人員開展了大量研究。Korner等研究沉水植物惠花狐尾藻的透析液作為培養(yǎng)基對(duì)藻類產(chǎn)生化感抑藻作用；Nakai等研究穗狀狐尾藻對(duì)銅綠微囊藻的抑制作用，得到穗狀狐尾藻培養(yǎng)液的過濾液對(duì)銅綠微囊藻的抑作用強(qiáng)于共培養(yǎng)下穗狀狐尾藻對(duì)銅綠微囊藻的抑制作用；Chen等研究發(fā)現(xiàn)水生菰、東方香蒲、黃色鳶尾（黃菖蒲）、蘆葦、蘆竹、睡蓮、蓮花和空心鏈子草培養(yǎng)液對(duì)銅綠微囊藻產(chǎn)生抑制作用；水生萵苣（水芙蓉）和水劍葉的培養(yǎng)液對(duì)銅綠微囊藻產(chǎn)生抑制作用；陸生植物如稻草、小麥稿桿、稻殼和西藏去皮大麥等浸泡液均對(duì)銅綠微囊藻具有抑藻作用。Leao等研究發(fā)現(xiàn)顫藻分泌物對(duì)小球藻具有很強(qiáng)的抑制作用，而對(duì)卷曲纖維藻抑藻作用不明顯，植物化感物質(zhì)對(duì)藻類的抑制作用具有選擇性。
總結(jié)前人研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)我國分布廣泛，多生于沼澤、湖邊以及濕地的灰化苔草化感抑藻研究鮮見報(bào)道�；一Σ葜饕植荚诤䴙I低地，內(nèi)湖、湖汊片狀連續(xù)生長，面積達(dá)9.6萬hm2，灰化苔草地上生物量為1 377—3 080 kg，hm2，鄱陽湖灰化苔草年產(chǎn)量數(shù)十萬噸。本研究鄱陽湖洲灘灰化苔草浸泡液對(duì)銅綠微囊藻生長的影響，以期揭示鄱陽湖岸灘灰化苔草在夏季漲水期對(duì)藍(lán)藻水華的作用，也為鄱陽湖洲灘灰化苔草對(duì)生態(tài)控制藍(lán)藻水華提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。
1 材料與方法
1.1 實(shí)驗(yàn)材料
藍(lán)藻門的銅綠微囊藻(Microcystis aeruginosa)購自中國科學(xué)院水生生物研究所。在500 mL錐形瓶中加入200 mL無菌培養(yǎng)基BG11，放置在光照培養(yǎng)箱中，保持溫度在(29±0.1)℃，光照強(qiáng)度2 500 lx．光照周期為24:0，每天搖動(dòng)3次，將處于對(duì)數(shù)生長期的藻種備用。
1.2 實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)液
鄱陽湖洲灘灰化苔草夾雜鮮苔草和枯苔草，本實(shí)驗(yàn)同時(shí)分別研究枯灰化苔草和鮮灰化苔草浸泡液對(duì)銅綠微囊藻的化感作用。取鄱陽湖洲灘灰化苔草，人工將枯灰化苔草和鮮灰化苔草分開，先人工清洗3次后超聲波中清洗40 min，再使用蒸餾水清洗3次，自然晾干�？莼一Σ莺王r灰化苔草分別剪為(2±0.2)cm小段，稱重后分別浸泡在1500 mL錐形瓶中分別加1000 mL蒸餾水浸泡，本實(shí)驗(yàn)采用蒸餾水作為浸泡液，得到單位體積內(nèi)苔草含量為0.12 g/mL。室內(nèi)浸泡16 d后將浸泡液過0.45 p4m微孔濾膜，過濾液按一定比例添加改良后的BG11培養(yǎng)基，得到不同植物生物量的培養(yǎng)基，即為對(duì)照組0 g/L和試驗(yàn)組6、12、24、48和72 g/L，調(diào)整培養(yǎng)基中TN和TP濃度分別到2和0.2 mg/L，將配置好的培養(yǎng)液使用30 W紫外燈滅菌120 min后備用，以實(shí)現(xiàn)無菌培養(yǎng)基。
1.3 實(shí)驗(yàn)方法
實(shí)驗(yàn)采用錐形瓶批式培養(yǎng)法，在250 mL錐形瓶中添加120 mL備用培養(yǎng)基，在光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行，控制溫度(29±0.5)℃，光照強(qiáng)度2 500 lx，光暗比14 h：10 h．初始藻密度20xl04 cell/mL，每天人工搖動(dòng)3次，再隨機(jī)放置。培養(yǎng)裝置使用30 W紫外燈殺菌2~4h，再進(jìn)行培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)；實(shí)驗(yàn)過程中嚴(yán)格無菌操作，實(shí)驗(yàn)過程每組設(shè)置3個(gè)平行樣。
1.4 分析方法
藻細(xì)胞計(jì)數(shù)采用血球板計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)，每隔ld在8:30從搖勻后的培養(yǎng)基中吸取l mL藻液至試管中，再取0.1 mL藻液在雙面光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)，3次計(jì)數(shù)取平均值。使用連接顯微鏡軟件拍相和圖像分析測(cè)量細(xì)胞直徑，采集藻細(xì)胞樣本至少200 cell;采用改進(jìn)的氮藍(lán)四唑法對(duì)超氧化物歧化酶(SOD)活力測(cè)定；采用硫代巴比脫酸方法測(cè)定膜脂過氧化產(chǎn)物丙二醛(MDA)含量；培養(yǎng)液TN、TP分別使用過硫酸鉀氧化法和鉬銻抗分光光度法。
浸泡液對(duì)銅綠微囊藻的抑制率計(jì)算公式為：/R=(No-N)/Noxl00%，式中：IR為抑制率；N。為對(duì)照組中藻密度，N為實(shí)驗(yàn)組中藻密度。
2 結(jié)果與討論
2.1 銅綠微囊藻的生長曲線
將枯灰化苔草和鮮灰化苔草不同生物量浸泡液作為培養(yǎng)基，將銅綠微囊藻密度隨時(shí)間變化作圖，如圖1所示。從圖l枯灰化苔草組中，試驗(yàn)組中銅綠微囊藻密度低于對(duì)照組中銅綠微囊藻密度，在培養(yǎng)過程中試驗(yàn)組銅綠微囊藻生物量先呈緩慢增加趨勢(shì)再變緩；銅綠微囊藻密度隨浸泡液生物量的增加而減少。
從圖1鮮灰化苔草組中可見，對(duì)照組中銅綠微囊藻密度遠(yuǎn)高于各試驗(yàn)組中銅綠微囊藻密度，試驗(yàn)組中銅綠微囊藻密度隨浸泡液中灰化苔草含量的增加而降低，在6 g/L和12 g/L實(shí)驗(yàn)組中銅綠微囊藻有輕微的增加趨勢(shì)，而在大于24 g/L灰化苔草生物量浸泡液培養(yǎng)基中銅綠微囊藻沒有出現(xiàn)對(duì)數(shù)生長期，在培養(yǎng)第6天后開始降低。枯灰化苔草和鮮灰化苔草浸泡液作為培養(yǎng)基，均對(duì)銅綠微囊藻生長產(chǎn)生化感抑制作用，培養(yǎng)7d后試驗(yàn)組中微囊藻細(xì)胞開始發(fā)黃、死亡分解，灰化苔草浸泡液化感抑藻能力隨浸泡液中灰化苔草生物量的增加而增加，出現(xiàn)劑量效應(yīng)( Dose-re-sponse)，Korner等研究穗狀狐尾藻的培養(yǎng)液對(duì)銅綠微囊藻的抑制試驗(yàn)也得到劑量效應(yīng)。
2.2 灰化苔草浸泡液對(duì)銅綠微囊藻的抑制率
選取第6天的枯灰化苔草和鮮灰化苔草浸泡液培養(yǎng)液中銅綠微囊藻密度，根據(jù)抑制率計(jì)算公式計(jì)算出銅綠微囊藻的抑制率繪圖，如圖2所示。從圖2可以看出，鮮灰化苔草浸泡液培養(yǎng)基中銅綠微囊藻抑制率在93%—95%之間，鮮灰化苔草浸泡植物生物量在6—72 g/L之間時(shí)銅綠微囊藻抑制率差異較小(p>0.05)；枯灰化苔草浸泡液培養(yǎng)銅綠微囊藻的實(shí)驗(yàn)組中抑制率在81%—88%之間，枯灰化苔草浸泡液對(duì)銅綠微囊藻的抑制率隨灰化苔草生物量的增加而增加，在枯灰化苔草生物量大于24 g/L的浸泡液對(duì)銅綠微囊藻抑制率差異較�。辉诟髟囼�(yàn)組中鮮灰化苔草浸泡液對(duì)銅綠微囊藻的抑制率較枯灰化苔草浸泡液對(duì)銅綠微囊藻的抑制率高，表明鮮灰化苔草和枯灰化苔草中均含有化感抑藻物質(zhì)，水浸泡提取鮮灰化苔草中所含化感物質(zhì)較枯灰化苔草更高。Su等使用稻草浸泡液培養(yǎng)基對(duì)銅綠微囊藻的抑制率在80%左右，潘琪等研究發(fā)現(xiàn)美人蕉種植水培養(yǎng)銅綠微囊藻20 d，對(duì)銅綠微囊藻的抑制率最高達(dá)64.4%，鄱陽湖洲灘優(yōu)勢(shì)植物灰化苔草具有較高的抑藻效果，可利用和開發(fā)鄱陽湖洲灘灰化苔草浸泡液抑藻特性，實(shí)現(xiàn)生態(tài)控制藍(lán)藻水華的目的。灰化苔草浸泡液中釋放的化感物質(zhì)需進(jìn)一步測(cè)定。
2.3 灰化苔草浸泡液對(duì)銅綠微囊藻細(xì)胞直徑的影響
將第6天測(cè)得銅綠微囊藻細(xì)胞直徑作圖，如圖3所示。從圖3可以看出對(duì)照組中藻細(xì)胞直徑大于試驗(yàn)組中藻細(xì)胞直徑，試驗(yàn)組中細(xì)胞直徑較對(duì)照組細(xì)胞直徑縮短8%~12%；對(duì)照試驗(yàn)組中銅綠微囊藻細(xì)胞直徑隨浸泡液植物生物量增加呈減小趨勢(shì)；鮮灰化苔草浸泡液中藻細(xì)胞直徑較枯灰化苔草浸泡液中藻細(xì)胞直徑小，鮮灰化苔草浸泡液與枯灰化苔草浸泡液中藻細(xì)胞直徑無顯著差異p>0.05）�；形镔|(zhì)可破壞細(xì)胞膜上巰基，降低膜完整性，從而致使胞內(nèi)物質(zhì)外流，細(xì)胞縮小，鮮灰化苔草和枯灰化苔草浸泡液中產(chǎn)生的化感物質(zhì)，使銅綠微囊藻受到脅迫并使細(xì)胞固縮，從而引起細(xì)胞凋亡，并且隨接觸時(shí)間的延長，抑制銅綠微囊藻細(xì)胞的生長，在蘚苔草浸泡液中出現(xiàn)藻細(xì)胞死亡現(xiàn)象，Zhang等在研究蛋白核小球藻與銅綠微囊藻的相互作用時(shí)，得到相似的結(jié)論。
2.4 灰化苔草浸泡液對(duì)銅綠微囊藻超氧化物歧化酶(SOD)活性的影響
將第3天測(cè)的銅綠微囊藻超氧化物歧化酶活性作圖，如圖4所示。從圖4可以看出對(duì)照組中銅綠微囊藻細(xì)胞SOD活性較試驗(yàn)組中藻細(xì)胞SOD活性高，試驗(yàn)組中藻細(xì)胞SOD活性降低，約占對(duì)照組細(xì)胞活性的0.3～0.57；各試驗(yàn)組中藻細(xì)胞SOD活性隨浸泡液植物生物含量的增加而降低，鮮灰化苔草浸泡液中藻細(xì)胞SOD活性在0.57—0.8 U/106 cell之間，枯灰化苔草浸出液中細(xì)胞SOD活性在0.67—1.14 U/106 cell之間，鮮灰化苔草浸泡液中藻細(xì)胞SOD活性較枯灰化苔草中藻細(xì)胞SOD活性更低。
化感物質(zhì)主要是破壞藻細(xì)胞結(jié)構(gòu)，改變?cè)宓墓夂献饔�，呼吸和酶活性等�?duì)藻類產(chǎn)生抑制作用，藻細(xì)胞受到灰化苔草浸泡液化感物質(zhì)脅迫時(shí)，藻細(xì)胞內(nèi)活性氧大量積累使藻細(xì)胞體內(nèi)SOD活性降低，使藻細(xì)胞體內(nèi)超氧陰離子不能及時(shí)清除，大量積累，不能有效防御活性氧或其它過氧化物自由基對(duì)細(xì)胞膜系統(tǒng)的傷害，從而自由基對(duì)藻細(xì)胞有機(jī)體產(chǎn)生毒害。
2.5 灰化苔草浸泡液對(duì)銅綠微囊藻丙二醛(MDA)含量的影響
丙二醛(MDA)是膜脂過氧化的最終分解產(chǎn)物，其含量可指示細(xì)胞內(nèi)反應(yīng)氧簇的多少和膜脂過氧化水平的高低，可作為細(xì)胞膜機(jī)構(gòu)損傷，藻體受脅迫程度的一種標(biāo)志。將第6天鮮灰化苔草和枯灰化苔草浸泡液中銅綠微囊藻膜脂過氧化含量作圖，見圖5。
從圖5可以看出在鮮灰化苔草和枯灰化苔草浸泡液的作用下，單位細(xì)胞內(nèi)丙二醛(MDA)含量均隨枯灰化苔草和鮮灰化苔草浸泡液生物含量的增加而增加，變化趨勢(shì)相似；Zhang等研究黃連對(duì)銅綠微囊藻化感抑制作用，發(fā)現(xiàn)藻細(xì)胞內(nèi)丙二醛積累使銅綠微囊藻氧化破壞而產(chǎn)生抑制作用；再力花根系分泌物、菖蒲和枯草等對(duì)銅綠微囊藻的化感抑制作用具有相似的作用。鮮灰化苔草和枯灰化苔草浸泡液試驗(yàn)組中單位細(xì)胞MDA含量是對(duì)照組3到4倍多，說明枯灰化苔草和鮮灰化苔草浸泡液含有化感物質(zhì)，使藻細(xì)胞內(nèi)活性氧積累，細(xì)胞膜脂過氧化，從而抑制銅綠微囊藻生長。
3 結(jié)論
(1)通過室內(nèi)試驗(yàn)首次得到，鄱陽湖洲灘優(yōu)勢(shì)植物枯灰化苔草和鮮灰化苔草浸泡液，均對(duì)銅綠微囊藻產(chǎn)生化感抑制作用；培養(yǎng)6d后灰化苔草浸泡生物量在6 g/L時(shí)，鮮灰化苔草和枯灰化苔草浸泡液對(duì)銅綠微囊藻的抑制率大于80%。
(2)銅綠微囊藻細(xì)胞在灰化苔草浸泡液長時(shí)間作用下，藻細(xì)胞直徑降低產(chǎn)生固縮現(xiàn)象，同時(shí)藻細(xì)胞體內(nèi)超氧化物歧化酶(SOD)活性降低，細(xì)胞內(nèi)丙二醛(MDA)含量增加；灰化苔草浸泡液對(duì)銅綠微囊藻細(xì)胞產(chǎn)生固縮，胞內(nèi)過氧化物的積累，對(duì)銅綠微囊藻產(chǎn)生抑制作用。
(3)鄱陽湖洲灘灰化苔草在漲水淹沒將對(duì)藍(lán)藻水華產(chǎn)生抑制作用，并為開發(fā)鄱陽湖洲灘灰化苔草在生態(tài)控藻中技術(shù)提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。需進(jìn)一步檢測(cè)苔草浸泡液化感抑藻物質(zhì)。
