利用開菲爾粒制作發(fā)酵乳飲料工藝技術(shù)研究
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曹凱1，邢軍2，普燕2，張瑞1*
1．新疆師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院（烏魯木齊830054）；2．新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院（烏魯木齊830046）
摘要采用響應(yīng)面法對開菲爾發(fā)酵乳飲料工藝進(jìn)行優(yōu)化。在單因素試驗基礎(chǔ)上，選擇開菲爾粒接種量、發(fā)酵時間和發(fā)酵溫度為自變量，以發(fā)酵乳飲料酸度及感官評價值確定的復(fù)合指標(biāo)為響應(yīng)值，利用Box-Benhnken中心組合方法進(jìn)行三因素三水平的試驗設(shè)計，并做響應(yīng)面分析，建立數(shù)學(xué)回歸模型。結(jié)果表明，曲面回歸方程擬合性好，利用開菲爾粒制作發(fā)酵乳飲料的最優(yōu)工藝條件為：開菲爾的接種量2.8%，發(fā)酵時間22 h，發(fā)酵溫度22℃。在優(yōu)化條件下經(jīng)3
次重復(fù)試驗驗證，預(yù)測值與驗證試驗平均值接近。說明該工藝穩(wěn)定、可行。
關(guān)鍵詞 開菲爾粒；發(fā)酵乳飲料；響應(yīng)面分析法
開菲爾粒是由數(shù)種乳酸菌與酵母菌等微生物之間的共生作用而形成的特殊顆粒狀結(jié)構(gòu)，多為白色或淺黃色，具有一定的彈性和特殊酸味，其中大約50%是黏性多糖（1：1比例的半乳糖和葡萄糖），此外，還有大量的水、少量蛋白質(zhì)、脂肪和其它成分。其最大的特點是具有很強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)能力和抗污染能力，因此開菲爾粒非常適用于家庭或工業(yè)化發(fā)酵乳制品的生產(chǎn)。人們直接將開菲爾粒添加到經(jīng)加熱滅菌、冷卻后的牛乳中，使之發(fā)酵而生成具有爽快酸味的保健品——開菲爾。
開菲爾具有較高的營養(yǎng)價值，含有消化性很高的乳蛋白質(zhì)和乳脂肪。蛋白質(zhì)中水溶性氮和氨基酸含量高，發(fā)酵過程中基本無損失；脂肪球小能夠充分乳化，更易消化吸收；游離脂肪酸和揮發(fā)性脂肪酸含量高，風(fēng)味良好。開菲爾中所含乳糖大部分被降解，經(jīng)發(fā)酵產(chǎn)生的乳酸為100%L(+)型，普通酸乳中的乳酸只有58%屬于右旋。右旋乳酸對人體有益。所以開菲爾乳除具有普通酸乳的保健作用外，更利于嬰兒食用。開菲爾中的維生素含量和種類也很多。
醋酸菌在代謝時合成維生素B2和尼克酸。酵母在發(fā)酵中合成維生素B1、維生素B2和維生素B12。微量丙酸菌代謝也能提高B族維生素的含量，其中B12和葉酸的含量比普通酸乳提高4～5倍。開菲爾的保健作用可以概括為：①提高免疫功能，強(qiáng)化免疫系統(tǒng)，增強(qiáng)免疫細(xì)胞活力，具有調(diào)節(jié)機(jī)體的特異性和非特異性免疫功能；②調(diào)節(jié)循環(huán)和呼吸系統(tǒng)的功能，開菲爾可增強(qiáng)心臟收縮力、呼吸加深、調(diào)整血壓、凈化血液以及調(diào)節(jié)血脂；③開菲爾可增強(qiáng)有益菌群的優(yōu)勢，刺激腸道，加強(qiáng)胃腸蠕動，加速唾液，胰酶的分泌，增加胃腸和胰臟的功能，增強(qiáng)消化系統(tǒng)功能；④具有防癌抗癌功能；⑤具有抗菌消炎的功能；⑥具有抗疲勞功能，開菲爾提高ATP活性，促進(jìn)機(jī)體代謝，有效地清除體內(nèi)代謝廢物，恢復(fù)體力，使精力旺盛；⑦具有恢復(fù)肝臟功能；另外開菲爾由于多種有益微生物菌相作用，使產(chǎn)品的營養(yǎng)比原乳有了很大提高，易于消化，成為具有豐富營養(yǎng)的保健食品。
新疆地區(qū)少數(shù)民族自古以來就有制作和食用發(fā)酵乳制品的習(xí)慣，傳統(tǒng)的乳制品制作方法有著明顯的地域性，做成的乳制品有著濃厚的地區(qū)特色和風(fēng)味。經(jīng)過幾千年的馴化，這些傳統(tǒng)乳制品中保留了許多具有傳代性好、抗逆性強(qiáng)以及風(fēng)味濃郁獨特的乳酸菌菌群。試驗主要研究了其中開菲爾粒制作發(fā)酵乳飲料的方法，以獲得地方特色風(fēng)味的乳制品加工工藝技術(shù)，以期更好地保護(hù)與利用傳統(tǒng)優(yōu)良發(fā)酵乳酸菌菌群，為其今后在發(fā)酵乳制品中合理應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。
1材料與方法
1.1材料與儀器
原料：烏魯木齊市南山山區(qū)牧民家庭制作奶疙瘩（2011年購得，自測水分含量為32.2%）；消毒乳：市售，新疆西域春乳業(yè)公司。
0.1 mol/L氫氧化鈉、酚酞、鄰苯二甲酸氫鉀。
HWS28型電熱恒溫水浴鍋：上海恒科學(xué)儀器有限公司；DHA-9123A型號電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海一恒科儀器有限公司；電子天平BS223S型：北京多賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；超凈工作臺：安泰公司。
1.2試驗方法
1.2.1開菲爾粒制備工藝
1.2.2開菲爾粒的活化
將原料奶在100℃下進(jìn)行滅菌，并將滅菌好的牛奶冷卻到25℃。然后以開菲爾粒與滅菌的牛奶1：20的質(zhì)量比配定，并在25℃下培養(yǎng)24 h。最后過濾得到開菲爾粒，測得開菲爾粒的酸度是350T，水分含量為59%。
1.2.3感官評價方法
先將感官評定標(biāo)準(zhǔn)及評定過程對8名實驗室研究人員進(jìn)行培訓(xùn)，再經(jīng)8人組成的無經(jīng)驗型感官評價人員（由實驗室研究人員組成）將試驗產(chǎn)品進(jìn)行評分檢驗，每組試驗重復(fù)3次，評分取平均值，分別評分后再進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計處理。
1.2.4 Na OH的標(biāo)定方法
1)準(zhǔn)確稱取0.5 g基準(zhǔn)試劑鄰苯二甲酸氫鉀3份，置于錐形瓶中標(biāo)號。
2)加25 m L新煮沸的冷蒸餾水，震蕩使其溶解，并設(shè)置一個空白試驗，再分別滴加2滴酚酞指示劑。
3)用配置好的氫氧化鈉溶液分別滴定至溶液呈微紅色，且30 s內(nèi)不褪色，記錄每次消耗氫氧化鈉的體積，按式(1)計算。
1.2.5酸度的測定方法
取樣品10 m L于試管中，攪拌均勻后滴入2～3滴酚酞指示劑，用0.1 mol/L的Na OH溶液滴定至紅色，在0.5 min內(nèi)不消失即為終點，記錄消耗Na OH溶液的體積，此體積乘以10即為乳制品酸度(0T)。
1.2.6開菲爾粒的接種量對發(fā)酵乳飲料發(fā)酵的影響
1)對牛奶進(jìn)行滅菌(加熱到100 ℃，保持20min)，然后將滅菌后的牛奶冷卻到25℃。
2)在滅菌好的200 g牛奶中加入開菲爾粒，接種量分別為1.5%，2%，2.5%，3%，3.5%和4%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)），編號分別為1，2，3，4，5和6，充分?jǐn)嚢瑁?5℃的條件下恒溫培養(yǎng)24 h，每組試驗重復(fù)3次。
3)感官評價不同條件下開菲爾的品質(zhì)，并記錄。然后以開菲爾粒的接種量為橫坐標(biāo)，以感官評分為縱坐標(biāo)，繪制開菲爾的接種量-感官曲線。找出相對的最好條件。
4)測量不同條件下開菲爾的酸度（分別滴加酚酞3滴，再用經(jīng)鄰苯二甲酸氫鉀標(biāo)定過的0.1 mol/L Na OH進(jìn)行滴定至微紅色，30 s不退色，記錄消耗氫氧化鈉的體積）。
5)以開菲爾粒的接種量為橫坐標(biāo)，以開菲爾的酸度為縱坐標(biāo)，繪制開菲爾粒的接種量-酸度曲線。研究不同開菲爾粒的接種量對開菲爾發(fā)酵的影響。
1.2.7時間對發(fā)酵乳飲料發(fā)酵的影響
1)在5份滅菌冷卻至25 ℃的牛奶200 g中加入開菲爾粒，接種量為2.5%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)），編號分別為1，2，3，4和5，充分?jǐn)嚢瑁?5℃的條件下分別培養(yǎng)18，20，22，24和26 h，每組試驗重復(fù)3次。
2)感官評價不同條件下開菲爾的品質(zhì)，并記錄。然后以時間為橫坐標(biāo)，感官評分為縱坐標(biāo)，繪制時間-感官評分曲線。找出發(fā)酵相對好的時間。
31測量不同條件下開菲爾的酸度。
41以時間為橫坐標(biāo)，以不同時間下開菲爾的酸度為縱坐標(biāo)，繪制時間-酸度曲線。研究發(fā)酵時間對開菲爾發(fā)酵的影響。
1.2.8溫度對發(fā)酵乳飲料發(fā)酵的影響。
1)在5份滅菌冷卻至25℃的牛奶200 g中加入開菲爾粒，接種量為2.5%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)），編號分別為1，2，3，4和5，充分?jǐn)嚢�，分別放在19 ℃，23 ℃，27 ℃, 31 ℃和35 ℃下進(jìn)行培養(yǎng)22 h，每組試驗重復(fù)3次。
2)感官評價不同條件下開菲爾的品質(zhì)，并記錄。以溫度為橫坐標(biāo)，以感官評分為縱坐標(biāo)，繪制溫度一感官曲線。找出相對好的發(fā)酵溫度。
3)測量不同條件下開菲爾的酸度。
4)以溫度為橫坐標(biāo)，以不同溫度下開菲爾的酸度為縱坐標(biāo)。繪制溫度-酸度曲線。研究溫度對開菲爾發(fā)酵的影響。
1.2.9響應(yīng)面法對乳飲料發(fā)酵工藝的優(yōu)化設(shè)計
正交設(shè)計僅能從試驗預(yù)先設(shè)定的幾個水平中優(yōu)選組合得到的最佳工藝條件，并非真實意義的最佳條件，只能說是理想條件，所以無法給出整個區(qū)域上因素的最佳組合的最優(yōu)值。響應(yīng)面分析法是一種尋找多因素系統(tǒng)中最佳條件的數(shù)學(xué)統(tǒng)計方法。由于采用了合理的試驗設(shè)計，能以最經(jīng)濟(jì)的方式，用很少的試驗數(shù)量和時間對試驗進(jìn)行全面研究，能在整個考察區(qū)域上確定各個因素的最佳組合及最有響應(yīng)值。所以試驗將通過單因素試驗設(shè)計篩選的對發(fā)酵乳飲料生產(chǎn)的主要因素進(jìn)一步采用響應(yīng)面法進(jìn)行優(yōu)化，得到最佳發(fā)酵條件，并為將來的發(fā)酵乳飲料生產(chǎn)提供科學(xué)依據(jù)。
在單因素考察基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面法確定影響水平，根據(jù)Box-Benhnken的中心組合試驗設(shè)計，采用三因素三水平進(jìn)行試驗，確定開菲爾粒發(fā)酵乳制品最佳工藝技術(shù)條件。試驗設(shè)計見表2。
1.2.10復(fù)合指標(biāo)的確定
試驗在進(jìn)行響應(yīng)面法優(yōu)化乳飲料發(fā)酵工藝時選用了復(fù)合指標(biāo)，在進(jìn)行單因素試驗時，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)酸度指標(biāo)與感官指標(biāo)具有較好的趨同性，因此可以將兩個指標(biāo)進(jìn)行權(quán)重整合，構(gòu)建復(fù)合指標(biāo)用于評價響應(yīng)面試驗數(shù)學(xué)理論模型與實踐中優(yōu)化數(shù)據(jù)的擬合情況。試驗中選取復(fù)合指標(biāo)：酸度值×50%+感官評分平均值×50%。
2結(jié)果與分析
2.1開菲爾粒的制備
如圖1所示，活化3次后獲得的開菲爾粒濕態(tài)，呈白色微小顆粒狀，具有黏性，開菲爾粒之間相互聚集成團(tuán)狀。
如圖2所示，干制后開菲爾粒為白色微小顆粒及其聚集而成的團(tuán)狀物。
2.2開菲爾粒接種量對開菲爾制品酸度及風(fēng)味的影響
由圖3可以看出開菲爾的酸度隨著開菲爾粒接種量的增加先增加后緩慢降低，在開菲爾粒的接種量為3%時酸度達(dá)到最大。但在開菲爾粒的接種量為2.5%時，開菲爾的感官條件最好。因此接下來兩組單因素試驗都是在此基礎(chǔ)上做的。當(dāng)接種量太少，則菌體細(xì)胞增長緩慢，發(fā)酵時間延長，且乳球菌產(chǎn)酸含量降低，從而影響產(chǎn)品中乳酸乙酯風(fēng)味物質(zhì)的形成。當(dāng)接種量過多時，在前期培養(yǎng)基的營養(yǎng)物質(zhì)消耗過快，即過多的利用乳糖繁殖菌體，而乳球菌利用乳糖產(chǎn)生大量乳酸使酸度相對較高，造成凝乳中蛋白質(zhì)脫水收縮嚴(yán)重，使乳清析出，出現(xiàn)分層，同時較多的接種量，會導(dǎo)致大量的酵母菌體早衰和自溶，產(chǎn)生發(fā)酵臭，從而影響開菲爾的風(fēng)味。
2.3時間對開菲爾制品酸度及風(fēng)味的影響
在開菲爾粒的接種量為2.5%的基礎(chǔ)上，由圖4可看出，隨著培養(yǎng)時間的增加，開菲爾的酸度先緩慢增加再緩慢降低，培養(yǎng)至22 h時，制品酸度最大，且此時的口感風(fēng)味也最好。若發(fā)酵時間較短，則乳酸菌產(chǎn)生乳酸量不足而導(dǎo)致產(chǎn)品酸度較低，同時，酵母菌產(chǎn)生的乙醇量亦不足，乙醇與乳酸作用生成乳酸乙酯的量就少，風(fēng)味欠佳。如果發(fā)酵時間過長，會導(dǎo)致產(chǎn)品酸度過高，產(chǎn)品適口性變差。
2.4溫度對開菲爾制品酸度及風(fēng)味的影響
由圖5可以看出，隨著溫度的增加，開菲爾的酸度呈現(xiàn)先增加后又略微減小的趨勢，27℃時制品酸度達(dá)到最高點。而在23℃左右時，開菲爾制品的感官評價指標(biāo)最好。發(fā)酵溫度較高時，雖然高溫促使乳球菌代謝旺盛，繁殖較快，使之發(fā)酵乳糖產(chǎn)生乳酸能力增強(qiáng)，但產(chǎn)酸過快容易導(dǎo)致乳清析出。同時，前期乳酸菌消耗過多的乳糖又不利于后期乳糖發(fā)酵性酵母利
用乳糖產(chǎn)生乙醇，從而使酒精度降低，導(dǎo)致產(chǎn)品醇味不足，而且較高溫度的發(fā)酵不利于后熟時柔和風(fēng)味物質(zhì)的產(chǎn)生，亦會降低產(chǎn)品的風(fēng)味品質(zhì)。若發(fā)酵溫度較低，雖然低溫有利于酵母菌生長，使之發(fā)酵乳糖產(chǎn)生乙醇能力增強(qiáng)，但在低溫條件下乳酸菌生長緩慢，產(chǎn)酸能力降低，產(chǎn)品酸味不足，從而影響產(chǎn)品的風(fēng)味品質(zhì)。另外隨著培養(yǎng)溫度的提高，發(fā)酵劑中的同型發(fā)酵乳酸菌（包括乳酸球菌和乳酸桿菌）的數(shù)量最終趨于一致，從而酸度基本不變，考慮以上兩個因素可以確定在24℃時開菲爾發(fā)酵的最佳。
2.5 響應(yīng)面法優(yōu)化試驗結(jié)果。
對表3數(shù)據(jù)進(jìn)行ANOVA分析，結(jié)果見表4。
由表3和4可得到開菲爾粒的接種量、時間、溫度與開菲爾酸度之間關(guān)系的二次多項回歸方程：
型p=0.000 6<0.01，表明該試驗采用的模型在統(tǒng)計學(xué)上是有意義的。失擬項用來表示所用模型與試驗擬合的程度，即二者差異的程度；p=0.375 2>0.05說明無失擬因素存在。由表3可知，單因素時間的p=0.009 3<0.01說明時間對開菲爾乳飲料發(fā)酵的復(fù)合指標(biāo)有極顯著的影響，單因素溫度的p<0.05說明溫度對開菲爾乳飲料發(fā)酵的復(fù)合指標(biāo)有顯著的影響，開菲爾粒的接種量、時間和溫度的二次項p值均小于0.01，說明這三者的二次項對開菲爾產(chǎn)品發(fā)酵的復(fù)合指標(biāo)有極顯著的影響。三者之間的交互作用對開菲爾發(fā)酵酸度的影響不顯著。表明試驗因子對響應(yīng)值不是簡單的線性關(guān)系，二次項對響應(yīng)值有很大的關(guān)系，這和模型回歸中的線性和平方項影響顯著項對應(yīng)。失擬項沒有顯著性影響，說明數(shù)據(jù)中沒有異常點，不需要引入更高次數(shù)的項，模型適當(dāng)。
2.6響應(yīng)面直觀分析
由圖6分析可知，響應(yīng)面的坡度較陡，可以得出開菲爾粒接種量和發(fā)酵時間的交互影響對開菲爾乳飲料發(fā)酵不夠顯著。通過等高線的疏密可以判斷在交互影響中時間對響應(yīng)值的影響大于開菲爾粒接種量。
由圖7分析可知，響應(yīng)面的坡度較陡，可以得出開菲爾粒接種量和發(fā)酵溫度的交互影響對開菲爾乳飲料發(fā)酵不夠顯著。通過等高線的疏密可以判斷在交互影響中開菲爾粒接種量對響應(yīng)值的影響大于溫度。
由圖8分析可知，響應(yīng)面的坡度較陡，可以得出發(fā)酵時間和發(fā)酵溫度的交互影響對開菲爾乳飲料發(fā)酵不夠顯著。通過等高線的疏密可以判斷在交互影響中發(fā)酵時間對響應(yīng)值的影響大于發(fā)酵溫度。
通過軟件分析，得到開菲爾發(fā)酵的最佳工藝參數(shù)為：開菲爾的接種量2.8%，時間21.93 h，溫度21.850C。此條件下開菲爾發(fā)酵的酸度是68.834 90T。感官條件最好。為檢驗響應(yīng)曲面法所得結(jié)果的可靠性，采用上述優(yōu)化工藝條件開菲爾的接種量2.8%、發(fā)酵時間為22 h以及發(fā)酵溫度22℃進(jìn)行驗證試驗，3次重復(fù)試驗結(jié)果：開菲爾發(fā)酵乳飲料酸度平均值為68.90T，感官評價平均值45與理論預(yù)測值酸度68.80T相比，其相對誤差較小，因此，基于響應(yīng)面分析法所得的開菲爾發(fā)酵乳飲料工藝技術(shù)參數(shù)準(zhǔn)確可靠，具有實用價值。
3結(jié)論
試驗證明響應(yīng)面分析法是優(yōu)化發(fā)酵工藝技術(shù)參數(shù)非常有效的工具，Box-Behnken試驗設(shè)計能建立各影響因素的二次多項數(shù)學(xué)模型，并利用統(tǒng)計學(xué)方法對該模型進(jìn)行了顯著性檢驗，優(yōu)化了內(nèi)在因素水平，找出最佳值。研究經(jīng)響應(yīng)面方法優(yōu)化，得出利用開菲爾粒制作發(fā)酵乳飲料的最優(yōu)工藝條件為：開菲爾的接種量2.8%、發(fā)酵時間22 h以及發(fā)酵溫度22℃。在優(yōu)化條件下經(jīng)3次重復(fù)試驗驗證，預(yù)測值與驗證試驗平均值接近。
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