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 吳曉鵬，李玖慧，唐嘉，易小平*

1．中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所（�？�571101）：2．農(nóng)業(yè)部熱帶作物生物學(xué)與遺傳資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（海口571101）

摘要采用高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)法測(cè)定木薯中果糖、葡萄糖、蔗糖和海藻糖的含量。樣品用水經(jīng)超聲波提取，用Xbridge-NH2色譜柱分離，流動(dòng)相為乙腈：水（水中加入0.2%的三乙胺）的體積比為70：30，流速為1.0m L/min，Elsd漂移管溫度為85℃，氮?dú)饬魉? L/m/n。在該條件下果糖、葡萄糖、蔗糖和海藻糖得到很好的分離，分別在1.5~ 25，1.5-25，2～25和1.5-25 μg的范圍內(nèi)有良好的線性范圍，相關(guān)系數(shù)R分別為0.999 1，0.999 1，0.999 0和0.999 3，最低檢出限分別為6.50，5.50，4.00和7.00 mg/kg，加標(biāo)回收率分別為97.6%, 98.6%，96.2%和95.4%。驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果表明，該方法快速、準(zhǔn)確，能用來(lái)測(cè)定木薯中單糖的含量。

關(guān)鍵詞  高效液相色譜一蒸發(fā)光散射檢測(cè)；木薯；單糖

 木薯（Manihot esculenta Crantz）為大戟科( Euphorbiaceae)木薯屬，又名木番薯、樹(shù)薯…，主要分布在巴西、尼日利亞、泰國(guó)和中國(guó)等100多個(gè)國(guó)家的熱帶地區(qū)，我國(guó)木薯種植主要分布在海南、廣西、廣東、福建和云南等地。木薯是世界上三大薯類作物之一，具有“地下糧倉(cāng)”、  “淀粉之王”和“特用作物”的美譽(yù)，目前，木薯的用途主要是食用、飼用和工業(yè)開(kāi)發(fā)利用這三方面，鮮薯主要用作于淀粉加工和酒精原料，也是世界公認(rèn)的具有發(fā)展?jié)摿Φ目稍偕�能源。木薯是我�?guó)最主要的生物乙醇的主要原料之一，也是我國(guó)第一種實(shí)現(xiàn)封閉運(yùn)行的非糧原料乙醇。

  糖在生物體內(nèi)普遍存在，是自然界分布最廣泛、數(shù)量最多的有機(jī)物。糖在生物體內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)直接影響到植物的生理活動(dòng)。目前糖含量測(cè)定方法有化學(xué)法、高效液相色譜法等，化學(xué)方因其準(zhǔn)確性低，只能測(cè)定還原性總糖，無(wú)法對(duì)具體還原性糖進(jìn)行定性和定量分析。因此，試驗(yàn)通過(guò)高效液相色譜一蒸發(fā)光散射檢測(cè)法測(cè)定木薯中單糖的含量，建立木薯中果糖、葡萄糖、蔗糖和海藻糖的測(cè)定方法，為木薯的開(kāi)發(fā)利用提供參考。

1  材料與方法

1.1材料與儀器

 木薯：中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所提供，水果木薯、華南124號(hào)、華南9號(hào)木薯、華南8號(hào)木薯和阿根廷7號(hào)木薯共5個(gè)品種，在根塊膨大期分別取塊根、莖和葉三個(gè)部位。

 果糖、葡萄糖、蔗糖和海藻糖標(biāo)準(zhǔn)品：Sigma公司；乙腈：色譜純；乙醇：分析純；超純水：電阻率為18.2MΩ ．cm,三乙胺：分析純；高純氮?dú)狻?/p>

 Waters e2695高效液相：Waters公司；3300 ELSD蒸發(fā)光檢測(cè)器：美國(guó)格蕾斯有限公司；AL104型電子天平：梅特勒一托利多（上海）有限公司；KS-8892型超聲波提取儀：寧波海曙科生超聲設(shè)備有限公司；2323K型離心機(jī)：德國(guó)Hermle公司。

1.2色譜條件

 色譜柱：Xbridge-NH2柱(250 mm'4.6 mm，3.6μm)：美國(guó)Waters；流動(dòng)相為乙腈：水（水中加入0.2%的三乙胺）體積比為70：30；柱溫：30℃；ELSD漂移管溫度85℃，載氣N2流速：2L/min。

1.3溶液的制備

1.3.1標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備

 精密稱取4種糖標(biāo)準(zhǔn)品各20.00 mg，分別至于5 m L容量瓶中，加入50%乙腈-水溶劑定容，搖勻，即得質(zhì)量濃度為4.00 mg/m L的4種糖的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3.2供試樣品溶液的制備

 木薯新鮮樣品，加入液氮研磨成粉末，精密稱量2 g+ 0.000 1 g左右，置于100 m L三角瓶?jī)?nèi)，加入800/0乙醇溶液50 m L，采用超聲波提取法超聲30 min，靜置后離心10 min，取上清液80℃烘干乙醇，加入乙腈一水（50：50，V:V）溶劑定容至10 m L，用0.45 μm有

機(jī)相膜過(guò)濾2～3次后待測(cè)。

1.4標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

 取標(biāo)準(zhǔn)品溶液適量，配成質(zhì)量濃度分別為2.50，2.00，1.50，1.00和0.50 mg/m L的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)樣量為10μL，每個(gè)質(zhì)量濃度作3次平行測(cè)定。以標(biāo)準(zhǔn)品峰面積為Y縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量X（μg）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.5精密度、加標(biāo)回收率和穩(wěn)定性試驗(yàn)

1.5.1精密度試驗(yàn)

  取一份木薯樣品，按照1.3.2方法制備溶液，平行進(jìn)行測(cè)定6次，進(jìn)樣量為10μ1進(jìn)行測(cè)定，比較4種糖的峰面積。

1.5.2穩(wěn)定性試驗(yàn)

 取一份木薯樣品，按照1.3.2方法制備溶液，分別在0，4，8，16和24 h進(jìn)行測(cè)定，進(jìn)樣量為10 μL進(jìn)行測(cè)定，比較4種糖的峰面積。

1.5.3加標(biāo)回收試驗(yàn)

 取同一木薯樣品葉片12份，分成4組，每組3個(gè)平行，分別加入果糖、葡萄糖、蔗糖和海藻糖各5 mg，按照1.3.2方法制備溶液，進(jìn)樣量10μ L，計(jì)算平均回收率。

2結(jié)果與討論。

2.1流動(dòng)相的選擇

 選用Waters Xbridge-NH2色譜柱，以流動(dòng)相為乙腈-水考察糖類化合物在氨基柱上的分離情況，結(jié)果表明，提高流動(dòng)相中水的比例可以縮短分離時(shí)間，但會(huì)使分離度下降，果糖與葡萄糖的峰部分重疊，而且水的比例過(guò)大會(huì)造成氨基柱的損傷；降低流動(dòng)相中水的比例可以使分離度變大，但分離時(shí)間延長(zhǎng)，峰寬嚴(yán)重。綜合考慮以上因素，當(dāng)流動(dòng)相：乙腈-水( 70：30，V: V)，流速為1 m L/min時(shí)，分離效果令人滿意。柱溫設(shè)為室溫30℃。氨基柱使用過(guò)程中，pH調(diào)節(jié)劑通常為氨水或三乙胺，因?yàn)榘彼�易揮發(fā)，在檢測(cè)過(guò)程，pH發(fā)生變化，糖類化合物在氨基柱上的分離效果也沒(méi)有三乙胺的效果好，因此，選擇在水相中加入0.2%的三乙胺。

2.2  ESLD參數(shù)的選擇

 ELSD檢測(cè)器的參數(shù)主要有漂移管溫度和載氣流速。漂移管溫度影響檢測(cè)器的響應(yīng)，溫度低時(shí)流動(dòng)相蒸發(fā)不完全，溫度升高，流動(dòng)相蒸發(fā)趨于完全，信噪比提高，但溫度過(guò)高會(huì)使流動(dòng)相沸騰，增加背景噪音，還可導(dǎo)致組分部分汽化，信號(hào)響應(yīng)值變小，最優(yōu)溫度為在流動(dòng)相基本蒸發(fā)完全的基礎(chǔ)上，產(chǎn)生可以接受的噪音的最低溫度，應(yīng)根據(jù)流動(dòng)相選擇合適的漂移

管溫度。

 一般來(lái)說(shuō)，載氣流速越小，形成的溶質(zhì)顆粒越大，散射光的強(qiáng)度越大，但是當(dāng)載氣流速太小時(shí)，流動(dòng)相蒸發(fā)不完全，背景噪音大，最優(yōu)的載氣流速應(yīng)是在產(chǎn)生可接受噪音的基礎(chǔ)上，產(chǎn)生最大響應(yīng)值的最低流速。以推薦值為起點(diǎn)，逐漸改變漂移管溫度或載氣流速，觀察基線噪音和響應(yīng)信號(hào)的大小。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)漂移管溫度為85℃，氮?dú)饬魉贋? L/min，噪音最小，響應(yīng)信號(hào)最強(qiáng)，故確定此條件為最佳條件。

2.3線性范圍和最低檢出限

 在相同的色譜條件下，分別以相同濃度不同進(jìn)樣體積的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行分析，測(cè)定峰面積與相應(yīng)糖的含量進(jìn)行線性回歸，以10倍信噪比（S/N）計(jì)算方法檢測(cè)低限。分析結(jié)果表明，線性關(guān)系良好，保留時(shí)間分別為6.083，6.618，8.354和9.970 min。標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的色譜圖分別為圖1(A)和圖1(B)。各標(biāo)準(zhǔn)品的回歸方程、線性相關(guān)系數(shù)和最低檢出限結(jié)果見(jiàn)表1。

2.4精密度試驗(yàn)

 制備好的木薯樣品溶液連續(xù)測(cè)定6次，四種糖的峰面積RSD值分別為1.72%，1.67%，1.84%和2.33%，結(jié)果顯示精密度良好。

2.5穩(wěn)定性試驗(yàn)

  制備好的木薯樣品溶液，分別在0，4，8，16和24 h進(jìn)行測(cè)定，4種糖的峰面積的RSD值分別為0.88%，0.48%，1.05%和1.91%，表明果糖、葡萄糖、蔗糖和海藻糖在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.6加標(biāo)回收率試驗(yàn)

試驗(yàn)結(jié)果如表2所示，表明該方法的回收率良好。

2.7樣品測(cè)定

 樣品結(jié)果分析如表3所示，華南124號(hào)木薯葉片中葡萄糖含量最高，華南8號(hào)木薯葉和阿根廷7號(hào)木薯葉蔗糖含量較高；華南8號(hào)木薯莖中葡萄糖含量較高，其他品種莖部各個(gè)糖含量差異不大；所有品種的塊根中蔗糖含量最高。試驗(yàn)結(jié)果與已發(fā)表的相比較，發(fā)現(xiàn)海藻糖的含量在葉片不同時(shí)期差異較大。

3結(jié)論

  試驗(yàn)結(jié)果顯示，采用超聲波水提法提取木薯中的單糖有較高的提取率。高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)法測(cè)定木薯中的單糖具有準(zhǔn)確度和靈敏度高的特點(diǎn)，可以用于木薯中單糖含量的測(cè)定。膨大期的木薯葉量達(dá)到生長(zhǎng)期的最高峰，通過(guò)此方法測(cè)定此時(shí)的木薯不同部位的糖含量，為木薯的綜合利用開(kāi)發(fā)提供基礎(chǔ)。