二氧化氯對(duì)食品中食源性致病菌殺菌效果研究
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高飛
中國(guó)食品藥品檢定研究院（北京100050）
摘要試驗(yàn)用二氧化氯(ClO2)溶液對(duì)已接種沙門氏菌和單增李斯特氏菌的黃瓜進(jìn)行浸泡處理，研究ClO2溶液質(zhì)量濃度、ClO2溶液溫度和處理時(shí)間這3個(gè)因素對(duì)殺菌效果的影響，并利用中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)(CCD)建立這3個(gè)因素與殺菌效果之間的數(shù)學(xué)模型。研究表明，隨著ClO2溶液質(zhì)量濃度和溫度增大，殺菌效果提高，處理時(shí)間延長(zhǎng)能提高殺菌效果，但上升趨勢(shì)隨時(shí)間延長(zhǎng)變得平緩。ClO2溶液質(zhì)量濃度、ClO2溶液溫度和處理時(shí)間對(duì)沙門氏茵和單增李氏菌的殺菌效果均有極顯著影響，且3個(gè)因素彼此之間交互作用顯著。對(duì)沙門氏菌和單增李斯特菌殺菌效果的影響順序分別為ClO2溶液溫度>處理時(shí)間> ClO2溶液質(zhì)量濃度、ClO2溶液溫度≥ClO2溶液質(zhì)量濃度>處理時(shí)間。ClO2對(duì)沙門氏菌和單增李斯特菌殺菌效果的數(shù)學(xué)模型預(yù)報(bào)值與實(shí)測(cè)值基本一致，相對(duì)誤差分別為1.20%和1.64%，建立的數(shù)學(xué)模型能描述-ClO2對(duì)黃瓜中沙門氏菌和單增李氏菌的殺菌規(guī)律，并能準(zhǔn)確預(yù)測(cè)殺菌效果。
關(guān)鍵詞二氧化氯；沙門氏菌；單增李斯特氏菌；黃瓜；殺菌效果
二氧化氯( ClO2)是目前國(guó)際上公認(rèn)的一種高效的果蔬表面化學(xué)殺菌劑和食品保鮮劑。ClO2可以防止乙烯生成，殺滅果蔬表面的腐敗菌來達(dá)到長(zhǎng)期保鮮，而且經(jīng)ClO2處理的果蔬，其風(fēng)味以及外觀品質(zhì)不受到影響。相比于傳統(tǒng)化學(xué)殺菌劑如氯氣、雙氧水等，ClO2氧化能力高、滲透能力和溶解能力高、反應(yīng)后不生成有害物質(zhì)、不產(chǎn)生異味，其應(yīng)用前景十分廣泛。沙門氏菌是一種常見的食源性致病菌，攝入了含有大量沙門氏菌屬的食品后，人體會(huì)產(chǎn)生惡心、嘔吐、腹痛、頭痛和腹瀉等。單增李斯特氏菌能在低溫、低pH和干燥環(huán)境中生長(zhǎng)，是一種病死率極高的食源性人畜共患致病菌。試驗(yàn)研究了ClO2對(duì)黃瓜中單增李斯特氏菌和沙門氏菌的殺菌效果，以期為果蔬保鮮提供另一途徑。
1 材料和方法
1.1原料
黃瓜：市售；沙門氏菌Salmonella typhimuriumLT2：中國(guó)藥品生物制品檢定所；單增李斯特氏菌NICPBP54002：中科院微生物研究所；ClO2緩釋劑：泰安嘉納利環(huán)�？萍加邢薰�；胰酪胨大豆酵母浸膏瓊脂( TSA-YE)培養(yǎng)基：上海銘博生物科技有限公司；PALCAM瓊脂：上海信帆生物科技有限公司；蛋白胨、牛肉膏、氯化鈉、瓊脂、蒸餾水等：實(shí)驗(yàn)室提供。
1.2試驗(yàn)儀器與設(shè)備
YXQ-LS-50SII全自動(dòng)高壓滅菌鍋：濟(jì)南奧諾生物工程有限公司；AUW220D分析天平：日本島津公司；HMGZT02潔凈工作臺(tái)：廣東鴻茂凈化設(shè)備實(shí)業(yè)有限公司；LRH-100-M生化培養(yǎng)箱：上海甄明科學(xué)儀器有限公司；JHX3H漩渦振蕩器：北京京輝凱業(yè)科技有限公司；PHS-3C pH計(jì)：上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；移液槍：北京譽(yù)朗諾科技有限公司；lDHG-9245A恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海越眾儀器設(shè)備有限公司；BCD-271TMCN冰箱：海爾集團(tuán)。
1.3試驗(yàn)方法
1.3.1 ClO2溶液的配置
準(zhǔn)確稱取0.250 g ClO2緩釋劑，無菌水60℃溶解，定容于已滅菌的100 m L容量瓶中，制得ClO2母液。用丙二酸碘量法測(cè)定ClO2含量。
1.3.2沙門氏菌和單增李斯特氏菌菌懸液的制備
沙門氏菌和單增李斯特氏菌于無菌環(huán)境中分別 接人TSB-YE培養(yǎng)基和營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（蛋白胨10.0 g、牛肉膏3.0 g、氯化鈉5.0 g、蒸餾水1 000 m L、pH 7.4)，37℃振蕩培養(yǎng)12 h，5 000 r/min離心5 min，除去培養(yǎng)基。無菌磷酸鹽緩沖液洗脫菌落。GB 4789.2-2010進(jìn)行平板菌落計(jì)數(shù)。稀釋菌液，調(diào)整兩種菌懸液的濃度分別都約為8 log CFU/m L。
1.3.3黃瓜表面接種
黃瓜使用前于4℃冰箱中貯藏。使用時(shí)先將黃瓜 分組并編號(hào)，無菌脫脂棉蘸取75%酒精擦拭黃瓜表面，之后用無菌刀于超凈工作臺(tái)內(nèi)橫切取10 +1 g，溫度恢復(fù)至室溫，紫外照射30 min。再用移液槍吸取10μ L稀釋后的菌懸液均勻多點(diǎn)涂布在黃瓜表面，于超凈臺(tái)中風(fēng)干30 min。黃瓜表面最終菌落數(shù)約為6 logCFU/m L。
1.3.4 ClO2溶液對(duì)接種黃瓜表面菌的處理與浸泡液中
殘留菌的檢測(cè)
在無菌環(huán)境中，將接菌后的黃瓜（沙門氏菌和單增李斯特菌）立即放于200 m L ClO2溶液中浸泡，處理一段時(shí)間后，放入含30 m L滅菌生理鹽水的無菌勻質(zhì)袋中拍打2 min，之后按GB 4789.2-2010進(jìn)行平板菌落計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)方法：選擇適宜稀釋度，之后用滅菌生理鹽水進(jìn)行稀釋。取100 VL的稀釋液進(jìn)行涂布，沙門氏菌試驗(yàn)組涂于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（蛋白胨10.0 g、牛肉膏3.0 g、氯化鈉5.0 g、瓊脂15.0 g、蒸餾水1 000 μL、pH 7.4)上，單增李斯特菌試驗(yàn)組涂于PALCAM瓊脂平板上，平皿放在37℃恒溫培養(yǎng)溫箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，計(jì)算平板內(nèi)的菌落數(shù)目，再乘以稀釋的倍數(shù)，就可以得到菌落總數(shù)。每個(gè)稀釋度做3個(gè)平行。同時(shí)設(shè)置自來水對(duì)照組，即用自來水浸泡黃瓜作為對(duì)照組。
1.3.5殺菌效果的評(píng)價(jià)
殺菌效果采用ClO2處理前后菌體數(shù)量對(duì)數(shù)的差值
2結(jié)果與分析
2.1 ClO2溶液質(zhì)量濃度對(duì)食源性致病菌殺菌效果的影響
黃瓜的接菌量為6.20±0.102 log CFU/m L，CIO2溶液溫度為20℃，分別在ClO2溶液質(zhì)量濃度為0，10，20，30，40和50 mg/L條件下，對(duì)黃瓜進(jìn)行了10 min的處理，觀察不同濃度ClO2的殺菌效果，結(jié)果如圖1所示。從圖1可看出，ClO2溶液質(zhì)量濃度為0 mg/L（即自來水對(duì)照組）沖洗黃瓜后，單增李斯特菌和沙門氏菌均有所減少，但減少程度不明顯。而ClO2溶液質(zhì)量濃度對(duì)單增李斯特菌和沙門氏菌均有明顯殺滅效果，隨著ClO2溶液質(zhì)量濃度的增大，殺滅效果更強(qiáng)，這可能是因?yàn)镃lO2溶液質(zhì)量濃度提高使得ClO2和菌體表面接觸機(jī)會(huì)提高，有利于其發(fā)揮殺菌作用。ClO2溶液對(duì)沙門氏菌的殺滅效果強(qiáng)于單增李斯特菌，因?yàn)閷?duì)于沙門氏菌，當(dāng)ClO2溶液質(zhì)量濃度為40 mg/L時(shí)，殺菌量達(dá)到最大為5.72 log CFU/m L，ClO2溶液質(zhì)量濃度增大至50 mg/L時(shí)，已發(fā)揮不了作用；而對(duì)于單增李斯特菌，當(dāng)ClO2溶液質(zhì)量濃度為50 mg/L時(shí)，殺菌量才達(dá)到最大為4.96 log CFU/m L，為了保證食用安全性，通常情況下ClO2溶液質(zhì)量濃度不應(yīng)超過50 mg/L。
2.2 ClO2溶液溫度對(duì)食源性致病菌殺菌效果的影響
黃瓜的接菌量為6.20±0.102 log CFU/m L，ClO2溶液質(zhì)量濃度為40 mg/L，分別在ClO2溶液溫度為0℃，5℃，10℃，15℃，20℃，25℃和30℃條件下，對(duì)黃瓜進(jìn)行了10 min的處理，觀察不同ClO2溶液溫度的殺菌效果，結(jié)果如圖2所示。從圖2可看出，隨著ClO2溶液溫度升高，殺菌量逐漸提高。對(duì)于沙門氏菌，當(dāng)ClO2溶液溫度為25 ℃時(shí)，大部分已被殺滅；對(duì)于單增李斯特菌，當(dāng)ClO2溶液溫度為5℃～15℃，殺菌效果輕微提高，提高程度不明顯，當(dāng)ClO2溶液溫度升到20℃時(shí)，殺菌效果大幅度提高，升到30℃時(shí)，殺菌量達(dá)到最大為5.64 log CFU/m L。在實(shí)際應(yīng)用中，應(yīng)跟隨季節(jié)及真菌種類的變化適當(dāng)調(diào)整ClO2溶液溫度，保證ClO2的殺菌率。
2.3處理時(shí)間對(duì)食源性致病菌殺菌效果的影響
黃瓜的接菌量為6.20±0.102 log CFU/m L，ClO2溶液質(zhì)量濃度為40 mg/L，在ClO2溶液溫度為20℃條件下，分別對(duì)黃瓜進(jìn)行了5，10，15，20，25和30 min的處理，觀察不同處理時(shí)間的殺菌效果，結(jié)果如圖3所示。從圖3可看出，ClO2溶液處理時(shí)間不同，對(duì)沙門氏菌和單增李斯特菌的殺菌量不同，這可能是因?yàn)閮煞N不同菌體表面與ClO2互作的位點(diǎn)有差異，所以對(duì)CIO2抗性有所不同。對(duì)于沙門氏菌，當(dāng)處理時(shí)間由5min延長(zhǎng)至15 min時(shí)，殺菌量明顯提高至6.05 log CFU/m L，之后進(jìn)一步延長(zhǎng)處理時(shí)間但殺菌量增加緩慢，甚至不增加，這可能是因?yàn)樘幚頃r(shí)間的延長(zhǎng)使得某些菌體發(fā)生應(yīng)急反應(yīng)，進(jìn)而菌體抗性增加，導(dǎo)致ClO2
殺菌效果下降。對(duì)于單增李斯特菌，隨著處理時(shí)間延長(zhǎng)，殺菌量逐漸增大，當(dāng)處理時(shí)間延長(zhǎng)至25 min時(shí)，殺菌量達(dá)到最大為5.73 log CFU/m L，延長(zhǎng)至30 min無法提高對(duì)單增李斯特菌的殺滅效果。在實(shí)際應(yīng)用中，還應(yīng)考慮較長(zhǎng)時(shí)間浸泡可能會(huì)影響黃瓜的品質(zhì)，因此應(yīng)選擇合理的殺菌處理時(shí)間。
2.4 ClO2對(duì)沙門氏菌殺菌效果的試驗(yàn)?zāi)Ｐ?
2.4.1 中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)
采用3因素3水平中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法( CCD)研究ClO2溶液質(zhì)量濃度、ClO2溶液溫度和處理時(shí)間對(duì)沙門氏菌殺菌效果的影響。殺菌試驗(yàn)的因素水平和結(jié)果分別見表1和2。
2.4.2 ClO2對(duì)沙門氏菌殺菌效果的數(shù)學(xué)模型
利用CCD建立的ClO2溶液質(zhì)量濃度、ClO2溶液溫度、處理時(shí)間與殺菌效果之間的數(shù)學(xué)模型：殺菌量=
對(duì)數(shù)學(xué)模型的顯著性和失擬性進(jìn)行檢驗(yàn)：失擬項(xiàng)的p=0.799 0，失擬檢驗(yàn)不顯著(p>0.05)，即模型適合；模型達(dá)到極顯著水平( p<0.000 1)；回歸方程具有較高的可信度。這說明了ClO2對(duì)沙門氏菌殺菌效果的模型和實(shí)際情況擬合度比較好，所以此模型可用于定量描述殺菌效果隨CIO2溶液質(zhì)量濃度、ClO2溶液溫度和處理時(shí)間的變化規(guī)律。
2.5 ClO2對(duì)單增李斯特菌殺菌效果的試驗(yàn)?zāi)Ｐ?
2.5.1 中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)
采用3因素3水平中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法( CCD)研究ClO2溶液質(zhì)量濃度、ClO2溶液溫度和處理時(shí)間對(duì)單增李斯特菌殺菌效果的影響。殺菌試驗(yàn)的因素水平和結(jié)果分別見表3和4。
2.5.2 ClO2對(duì)單增李斯特菌殺菌效果的數(shù)學(xué)模型
利用CCD建立的ClO2溶液質(zhì)量濃度、ClO2溶液溫度、處理時(shí)間與殺菌效果之間的數(shù)學(xué)模型：殺 對(duì)數(shù)學(xué)模型的顯著性與失擬性進(jìn)行檢驗(yàn)：失擬項(xiàng)的p=0.337 5，失擬檢驗(yàn)不顯著(p>0.05)，即模型適合；模型達(dá)到極顯著水平( p<0.000 1)；回歸方程具有較高的可信度。這說明了ClO2對(duì)單增李斯特菌殺菌效果的模型和實(shí)際情況擬合度比較好，所以此模型可用于定量描述殺菌效果隨ClO2溶液質(zhì)量濃度、CIO2溶液溫度和處理時(shí)間的變化規(guī)律。
3結(jié)論與討論
ClO2對(duì)黃瓜中的沙門氏菌和單增李氏菌均有很好的殺菌效果，隨著ClO2溶液質(zhì)量濃度和溫度增大，殺菌效果提高，處理時(shí)間延長(zhǎng)能提高殺菌效果，但上升趨勢(shì)隨時(shí)間延長(zhǎng)變得平緩。
ClO2溶液質(zhì)量濃度、ClO2溶液溫度和處理時(shí)間對(duì)沙門氏菌和單增李氏菌的殺菌效果均有極顯著影響，且3個(gè)因素彼此之間交互作用顯著。對(duì)沙門氏菌和單增李斯特菌殺菌效果的影響順序分別為ClO2溶液溫度>處理時(shí)間>ClO2溶液質(zhì)量濃度、ClO2溶液溫度>ClO2溶液質(zhì)量濃度>處理時(shí)間。CIO2對(duì)沙門氏菌和單增李斯特菌殺菌效果的數(shù)學(xué)模型預(yù)報(bào)值與實(shí)測(cè)值基本一致，相對(duì)誤差分別為1.20%和1.64%，因此利用中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)( CCD)建立的數(shù)學(xué)模型能描述ClO2對(duì)黃瓜中沙門氏菌和單增李氏菌的殺菌規(guī)律，并能準(zhǔn)確預(yù)測(cè)殺菌效果。
ClO2溶液對(duì)于沙門氏菌和單增李斯特菌的作用結(jié)果是由ClO2溶液質(zhì)量濃度、ClO2溶液溫度和處理時(shí)間多種因素綜合作用的。在實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用中，需要同時(shí)考慮殺菌率和成本，因此可合理地調(diào)節(jié)ClO2溶液質(zhì)量濃度、提高ClO2溶液溫度或者延長(zhǎng)處理時(shí)間來增強(qiáng)ClO2溶液殺菌的效果。CIO2具有無殘留毒性、低成本的優(yōu)點(diǎn)，是一種理想的果蔬殺菌保鮮劑，給現(xiàn)代果蔬安全質(zhì)量的提高和延長(zhǎng)貨架期提供了新的發(fā)展方向。
