海藻酸鈉在淀粉酶的固定化中的應(yīng)用
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吳效楠，溫守東，劉濤
承德石油高等�？茖W(xué)�；瘜W(xué)工程系（承德067000）
摘要海藻酸鈉是一種安全性較高且生產(chǎn)成本較低的材料，淀粉酶在食品工業(yè)、造紙業(yè)、酒精行業(yè)及日化用品等多個(gè)領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。海藻酸鈉由于其生物安全性、良好的成膠成球特性及低廉的生產(chǎn)成本在酶的固定化方面有較廣泛的應(yīng)用。單一淀粉酶對pH及有機(jī)溶劑較敏感，高溫下不夠穩(wěn)定，在一定程度上限制了其應(yīng)用。因此’需要對淀粉酶進(jìn)行固定化以提高其穩(wěn)定性。將對海藻酸鈉固定淀粉酶的進(jìn)展進(jìn)行綜述并對未來的發(fā)展進(jìn)行展望。
關(guān)鍵詞 海藻酸鈉；淀粉酶；固定化；穩(wěn)定性
海藻酸鈉是一種來源與海藻中的天然多糖，由于其穩(wěn)定性、溶解性和安全性用作藥物制劑輔料以及酶制劑的固定化。
淀粉酶是水解淀粉和糖原糖類的總稱，淀粉酶由 于其高效性、專一性及生物安全性被廣泛應(yīng)用于面包烘烤、飲料制備、纖維脫漿、造紙工業(yè)、除垢劑、臨床制藥和化學(xué)分析等方面。淀粉酶在很多條件下需要在溫度比較高、偏酸偏堿或表面活性劑存在的環(huán)境下應(yīng)用。因此，對淀粉酶的穩(wěn)定性要求較高。固定化酶是指在一定空間內(nèi)呈現(xiàn)封閉狀態(tài)同時(shí)能保留其催化特性并能反復(fù)回收利用的酶。
固定化酶相比游離酶具有穩(wěn)定性更強(qiáng)、更耐酸耐堿、可反復(fù)使用降低成本、可對反應(yīng)進(jìn)行精確控制、對蛋白酶的耐受性更強(qiáng)和更耐變性劑等優(yōu)點(diǎn)。因此，十分有必要對淀粉酶的固定化工藝進(jìn)行深入研究，而海藻酸鈉是較為成熟的酶固定化載體，具有成本低、生物安全性好和固定酶容量較大等優(yōu)勢，因此對海藻酸鈉在酶固定化方面的應(yīng)用進(jìn)行綜述。
1 酶固定化載體及方法
1.1酶固定化載體
載體是對酶進(jìn)行固定化的關(guān)鍵，理想的酶固定化載體應(yīng)該具有如下特性：(1)生物安全性較好；(2)性質(zhì)穩(wěn)定，不易被降解；(3)傳質(zhì)性能良好；(4)機(jī)械強(qiáng)度高，使用壽命長；(5)不與反應(yīng)液及產(chǎn)物發(fā)生化學(xué)反應(yīng)；(6)操作簡便且成本低廉。常用的固定化載體可以分為無機(jī)載體、有機(jī)高分子載體和天然高分子載體。天然高分子載體包括海藻酸鈉、瓊脂、纖維素和殼聚糖等；有機(jī)高分子材料包括光交聯(lián)樹脂、聚氨酯、聚乙烯醇、硅膠和聚丙烯酰胺等。有機(jī)高分子載體一般穩(wěn)定性和機(jī)械強(qiáng)度較好，但傳質(zhì)性能相對較差。天然高分子凝膠一般傳熱傳質(zhì)性能較好，但機(jī)械強(qiáng)度相對較弱。
1.2酶的固定化常用方法
酶的固定化是指采用物理或化學(xué)方法將蛋白酶以物理吸附方式、共價(jià)鍵結(jié)合或非共價(jià)鍵結(jié)合等方式，將酶固定于特定的載體上，將酶束縛在特定區(qū)域的同時(shí)保持酶的催化特性。固定化酶要遵循以下原則：(1)維持酶的催化活性及專一性；(2)載體必須有足夠的機(jī)械強(qiáng)度；(3)固定化酶載體的空間位阻要盡量小，減少對酶和底物結(jié)合的影響；(4)酶與載體要牢固結(jié)合，利于反復(fù)使用；(5)固定化酶要易于與產(chǎn)物分離；(6)要具有很好的穩(wěn)定性，成本要相對低廉。常見的酶固定化方法包括吸附法、包埋法、交聯(lián)法、共價(jià)結(jié)合法和熱處理法5種方法。這種方法工藝簡便，條件溫和，可同時(shí)實(shí)現(xiàn)酶的固定和純化。
1.2.1吸附法
吸附法是指通過載體表面與酶分子間次級鍵的相互作用而制備固定化酶的方法，可分為物理吸附法以及離子交換吸附法，吸附法具有操作方便，所需條件溫和，固定化酶的活力回收率較高，載體可再生，成本較低，有時(shí)可同時(shí)實(shí)現(xiàn)酶的固定和純化等優(yōu)點(diǎn)。但這種方法固定的酶與載體之間的相互作用力太弱，主要包括氫鍵、離子鍵和疏水鍵等，容易受到緩沖液pH、離子強(qiáng)度等的影響導(dǎo)致蛋白酶與載體的分離。
1.2.2包埋法
包埋法是采用凝膠、微囊、脂質(zhì)體和半透膜將酶包埋在其中，所以可分為凝膠包埋法、半透膜包埋法、微囊包埋法和脂質(zhì)體包埋法四種。這種方法的操作條件較為溫和，對酶的功能特性影響較小，酶與載體的結(jié)合力較強(qiáng)，成本較低。如海藻酸鈉固定蛋白酶一般采用凝膠包埋法，以增加淀粉酶的穩(wěn)定性及對極端環(huán)境的耐受性�？梢杂镁郾０纺z包埋含延胡索酸的產(chǎn)氨短桿菌菌體，制成固定化延胡索酸酶，從延胡索酸制造L-蘋果酸。
1.2.3交聯(lián)法
交聯(lián)法是將游離酶的氨基酸殘基與不同的交聯(lián)劑反應(yīng)使兩者之間產(chǎn)生化學(xué)鍵從而對酶進(jìn)行固定化，使用交聯(lián)法載體與酶之間的結(jié)合力很強(qiáng)，固定強(qiáng)度大，可以長時(shí)間使用。但這種方法也存在缺點(diǎn)，即所采用的交聯(lián)劑一般為有機(jī)過氧化物，最常用的為氧化二異丙苯，反應(yīng)條件比較劇烈，對酶的活力影響比較大，因此，酶活力回收率低，交聯(lián)法一般與其他方法聯(lián)合使用，如與吸附法或包埋法聯(lián)合使用，可以降低對酶活力的損害。目前交聯(lián)法主要應(yīng)用在酶膜和免疫分子膜的制備中�？碌律壤梦於┛梢耘c蛋白酶的游離氨基酸形成Schiff堿而使酶分子交聯(lián)的原理對糖化酶進(jìn)行固定，并優(yōu)化了戊二醛固定糖化酶的條件，發(fā)現(xiàn)酸性條件下，低于0.5%的戊二醛濃度進(jìn)行固定化有利于提高固定化酶的穩(wěn)定性。
1.2.4共價(jià)結(jié)合法
共價(jià)結(jié)合法是將酶與載體通過共價(jià)鍵（包括巰基、羥基、羧基、氨基、酚基和咪唑基等）結(jié)合從而對酶進(jìn)行固定化的方法。這種方法酶與載體間的結(jié)合相對牢固，固定化酶的穩(wěn)定性較好，可以進(jìn)行多次反應(yīng)。但這種方法反應(yīng)條件劇烈，會在一定程度上破壞蛋白質(zhì)的高級結(jié)構(gòu)，因此，對酶活力損失較大，一般酶活回收率在30%左右。而且共價(jià)結(jié)合法固定化酶對底物的專一性有影響，制備工藝復(fù)雜，固定化成本較高。
1.2.5熱處理法
熱處理法是指將含有酶的細(xì)胞在一定溫度下進(jìn)行加熱處理，從而將酶固定在菌體內(nèi)部。該方法工藝相對簡單，成本也低廉，但該方法僅僅適用于具有較好熱穩(wěn)定性的酶。例如將含葡萄糖異構(gòu)酶的放線菌細(xì)胞在660C～65 0C處理15 min，葡萄糖異構(gòu)酶就固定在菌體上，可用于連續(xù)生產(chǎn)葡萄漿。
1.2.6結(jié)晶法
結(jié)晶法固定化酶就是酶結(jié)晶的方法實(shí)現(xiàn)酶的固定化。酶晶體可以實(shí)現(xiàn)酶的富集，提供高濃度的酶，這對于活力低的酶非常重要，因?yàn)橥ㄟ^結(jié)晶可以提高單位體積內(nèi)酶的活力，這可以大大縮短酶的反應(yīng)時(shí)間。但結(jié)晶法固定化酶存在一定的損耗，成本也相對較高。
2海藻酸鈉固定化淀粉酶研究進(jìn)展
理想的載體對酶進(jìn)行固定化后對酶的性質(zhì)改變?nèi)缦拢?1)固定化酶的熱穩(wěn)定性比游離酶好，一般來說最適反應(yīng)溫度升高，對蛋白酶的抗性增加，對變性劑的耐受性提升；(2)采用帶正電荷的載體固定化酶時(shí)，最適反應(yīng)pH會有所降低，采用帶負(fù)電荷的載體固定化酶時(shí)，最適反應(yīng)pH升高；不帶電荷載體固定化酶則對最適反應(yīng)pH沒有影響；(3)如果酶的底物為
小分子，則載體的空間位阻對于酶與底物的結(jié)合影響較小，則底物特異性改變不大；如果酶的作用底物為大分子，則載體會影響酶與底物的結(jié)合，酶的底物特異性會發(fā)生變化。(4) -般來說固定化酶的米氏常數(shù)要高于游離酶，這是因?yàn)檩d體的空間位阻妨礙底物進(jìn)入到固定化酶中，因此，底物需要更高的濃度才能達(dá)到最大反應(yīng)速度。
2.1海藻酸鈉適合作為固定化酶的載體
海藻酸鈉是從海水中提取的親水性膠態(tài)多聚糖，英國化學(xué)家最早于1881年在對海藻的海藻酸鹽進(jìn)行提取時(shí)獲得，發(fā)現(xiàn)其具有濃縮原料和成膜能力，其分子式如圖1所示，它由β-(1，4)-D-甘露糖醛酸（M單元）和a-(1，4)-L-古羅糖醛酸（G單元）組成，由于其分子中含有較多的自由羧基和羥基，可溶于不同溫度的水中，因此其生物相容性較好，海藻酸鈉本質(zhì)是一種多糖，因此安全無毒，其成膜性能和成球性能好，是固定化酶理想的載體材料。
海藻酸鈉能與鈣離子結(jié)合形成特殊的“Egg-box”結(jié)構(gòu)，基于海藻酸鈉的這種特性，可以聯(lián)合氯化鈣水溶液和海藻酸鈉從而實(shí)現(xiàn)對酶的固定化。
2.2海藻酸鈉在淀粉酶固定化中的應(yīng)用
淀粉酶是能水解淀粉和糖原的酶類的統(tǒng)稱，是迄今為止用途最廣泛、產(chǎn)量最大的酶制劑之一。根據(jù)水解淀粉方式和作用底物的不同，可以分為a-淀粉酶、β-淀粉酶、葡糖糖淀粉酶和解枝酶四種。淀粉酶可以廣泛應(yīng)用于食品加工、糧食工業(yè)、紡織工業(yè)、酒精工業(yè)和發(fā)酵工業(yè)等多種行業(yè)，是應(yīng)用最廣泛的酶制劑之一。
由于淀粉酶應(yīng)用范圍廣泛，而且經(jīng)常需要應(yīng)用于高溫、偏酸、偏堿和多種表面活性劑存在的特殊環(huán)境中，單純的淀粉酶對于酸、堿及有機(jī)溶劑十分敏感，在加工過程中十分容易失活。因此，需要對淀粉酶進(jìn)行固定化以提高酶的穩(wěn)定性和對極端環(huán)境的耐受性。
2.2.1 采用海藻酸鹽以外的高分子載體固定化淀粉酶
我國在淀粉酶的固定化方面取得了一系列進(jìn)展，陳莉敏等以殼聚糖為載體，以戊二醛為交聯(lián)劑對淀粉酶進(jìn)行固定化，結(jié)果表明，經(jīng)過固定化后，酶的最適反應(yīng)pH未發(fā)生變化，而戊二醛導(dǎo)致淀粉酶的活性明顯下降。王玉潔等以乙基纖維素為載體，利用高分子沉淀技術(shù)制備a-淀粉酶，可以較好地對a-淀粉酶微膠囊化并得到較高的產(chǎn)率。玄光善等以尼龍為載體，通過化學(xué)鍵合法對a-淀粉酶進(jìn)行固定化。經(jīng)過固定化后，酶的最適pH由6.3升至7.2，最適反應(yīng)溫度由60℃提高至70℃，固定化酶的熱穩(wěn)定性較好，固定化酶在4℃水溶液中放置14 d仍然可以保留79%～89%的酶活力，固定化酶應(yīng)用于鄰硝基對于對甲基苯酚的還原率為37.1%。張青等采用碳納米管對淀粉酶和糖化酶進(jìn)行了共固定，首先用硝酸回流法對碳納米管進(jìn)行純化，再用混酸法對其進(jìn)行氧化，在碳納米管上引入羧基，固定pH為5.0，反應(yīng)溫度為20℃，共固定酶的酶活力能保持在60%以上，比固定單一酶生成葡萄糖的速率要高l5%。
2.2.2海藻酸鈉在固定化淀粉酶方面的應(yīng)用
朱啟鐘等分別采用殼聚糖交聯(lián)法和海藻酸鈉微膠囊法對淀粉酶進(jìn)行了固定化，采用海藻酸鈉固定化的淀粉酶酶活力為27.4 U/mg，酶活力回收率為33.2%，采用殼聚糖交聯(lián)法固定化淀粉酶的活力為24.2 U/mg，酶活力回收率26.6%。殼聚糖交聯(lián)法制備的固定化酶在40℃～60℃保持較高的酶活力，而海藻酸鈉固定化酶在50℃～80℃保持較高酶活力�？赡苁敲附�(jīng)過固定化后，剛性增加，需要較高的溫度，提高其柔性，以便于底物與固定化酶的結(jié)合。海藻酸鈉固定化酶的最適pH為8.0，而殼聚糖的最適反應(yīng)pH為5.0，前者抗pH變化的能力更強(qiáng)，前者的貯藏穩(wěn)定性也優(yōu)于后者，抗高溫能力也更強(qiáng)，前者機(jī)械強(qiáng)度也更強(qiáng)，反復(fù)使用10次還能保持80%以上的酶活力，初步推測主要是因?yàn)閮烧咚鶐У幕鶊F(tuán)不同以及形成凝膠網(wǎng)狀的結(jié)構(gòu)及機(jī)械強(qiáng)度不同所致。充分說明海藻酸鈉更適合于淀粉酶的固定化。陳青等采用響應(yīng)面法對海藻酸鈉固定淀粉酶的條件進(jìn)行了優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)海藻酸鈉濃度為2.48%，氯化鈣濃度為2.04%，游離酶濃度為0.23%，在此條件下，固定化酶的回收率高達(dá)74%。
2.2.3海藻酸鈉聯(lián)合其他載體固定化淀粉酶
單一采用海藻酸鈉固定淀粉酶可能在酶的穩(wěn)定性、載體的機(jī)械強(qiáng)度及酶對環(huán)境的耐受性方面仍有待提高，因此，許多研究者展開了海藻酸鈉聯(lián)合其他載體固定化淀粉酶方面的研究。祝美云等以海藻酸鈣、明膠和戊二醛為載體材料，對a-淀粉酶進(jìn)行固定化，并探討了酶的最佳固定化條件和固定化酶的酶學(xué)性質(zhì)，酶經(jīng)過固定化后，酶的最適反應(yīng)pH由6.0降至5.6，最適反應(yīng)溫度由65℃提高至70℃，固定化酶的熱穩(wěn)定性顯著提升。連續(xù)應(yīng)用7次后仍然能保持80%左右的酶活力。
顧旭炯等聯(lián)合使用海藻酸鈉和氯化鈣，采用凝膠包埋法共固定a-淀粉酶和糖化酶，共固定化酶體系的最適反應(yīng)溫度為60℃，最適pH為4.5，固定化酶的熱穩(wěn)定性和連續(xù)操性都比較好。
唐鵬程等采用海藻酸鈉和卡拉膠共包埋固定化淀粉酶，所得固定化酶的酶活力回收率為5 5.7%，最適反應(yīng)pH由7.0降至6.0，最佳反應(yīng)溫度由60℃提高至70℃，所得固定化酶在連續(xù)操作5次后還能保持75%以上的酶活力，其熱穩(wěn)定性也得到顯著提高。
王冕等采用海藻酸鈉與阿拉伯膠為載體固定糖化酶，以酶活力的回收率作為評價(jià)指標(biāo)，通過響應(yīng)面法優(yōu)化固定化條件，得到固定化酶的最佳工藝條件為海藻酸鈉與阿拉伯膠質(zhì)量比為2.7：1，氯化鈣質(zhì)量濃度為62 mg/m L，固定化時(shí)間為0.8 h，固定化酶的酶活回收率為67.91%。固定糖化酶的熱穩(wěn)定性有所提升。
3結(jié)論與展望
海藻酸鈉由于其安全性、低成本、良好的成球成膜性、高機(jī)械強(qiáng)度和穩(wěn)定性被廣泛應(yīng)用于酶的固定化。淀粉酶由于其廣泛應(yīng)用于各個(gè)工業(yè)領(lǐng)域且淀粉酶本身對于酸堿及各種有機(jī)溶劑比較敏感，因此，海藻酸鈉適合應(yīng)用于淀粉酶的固定化，以提高淀粉酶的穩(wěn)定性及其對于極端環(huán)境的耐受性。相比其他固定化載體，海藻酸鈉具有制備簡單、機(jī)械強(qiáng)度高、穩(wěn)定性
好、反復(fù)多次使用后仍保持較好的酶活力、酶活力損失小并可以在很大程度上提高淀粉酶的熱穩(wěn)定性的優(yōu)點(diǎn)。但在海藻酸鈉固定化淀粉酶的過程中，仍需注意以下幾點(diǎn)： (1)固定化淀粉酶的工藝包括pH、溫度、海藻酸鈉濃度和酶濃度等需要進(jìn)行優(yōu)化，以最大程度提高蛋白酶的酶活力回收率；(2)可以結(jié)合其他載體材料如明膠、卡拉膠、黃原膠和碳納米管等固定化淀粉酶，以最大程度提高固定化酶的穩(wěn)定性；(3)可以共包埋其他酶包括糖化酶等，通過酶的協(xié)同作用以最大程度提高酶的活力及穩(wěn)定性；(4)可以通過基因工程手段對淀粉酶進(jìn)行遺傳工程改造，以最大程度提高淀粉酶的活力及熱穩(wěn)定性。相信隨著材料學(xué)、分子生物學(xué)及機(jī)械化工藝的發(fā)展，海藻酸鈉在淀粉酶的固定化方面可以更好地發(fā)揮其作用，以提高淀粉酶的酶活力及穩(wěn)定性，促進(jìn)淀粉酶在各個(gè)工業(yè)領(lǐng)域的應(yīng)用。
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