谷氨酰胺酶水解小麥蛋白工藝研究
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王建中1，馮中2，李領(lǐng)川2
1．河南省食品工業(yè)科學(xué)研究所有限公司（鄭州450053）；2．中州大學(xué)（鄭州450044）
摘要 以溶解度、脫酰胺度為考察指標，研究蛋白質(zhì)谷氨酰胺酶對小麥蛋白進行酶解改性的工藝。通過單因素及正交試驗，對蛋白質(zhì)谷氨酰胺酶酶解谷朊蛋白進行了工藝條件的優(yōu)化。探討蛋白質(zhì)谷氨酰胺酶與谷朊蛋白質(zhì)量比、酶解溫度、酶解時間和酶解pH 4個工藝參數(shù)對酶解谷朊蛋白溶解度及脫酰胺度的影響，確定了蛋白質(zhì)谷氨酰胺酶解改性小麥蛋白的最佳工藝條件：谷氨酰胺酶與谷朊蛋白質(zhì)量比0.05：1，酶解溫度450C,酶解時間26 h，酶解pH 7.3。在此酶解工藝優(yōu)化條件下，谷朊蛋白溶解度為82.36%,脫酰胺度為45.76%。
關(guān)鍵詞 小麥蛋白；蛋白質(zhì)谷氨酰胺酶：酶解改性；條件優(yōu)化
小麥面筋蛋白又稱小麥蛋白或谷朊蛋白，指以小麥為原料，用水洗去淀粉和其它水溶性物質(zhì)后剩下的未變性的面筋粉體，它是小麥淀粉生產(chǎn)的副產(chǎn)物。目前，開拓小麥蛋白在食品和非食品領(lǐng)域中的應(yīng)用，已成為國內(nèi)外關(guān)注的熱點。由于小麥蛋白含有較多的疏水性氨基酸：谷氨酰胺和天冬酰胺殘基，這些氨基酸通過氫鍵等作用把蛋白質(zhì)連接在一起，造成蛋白質(zhì)凝聚、產(chǎn)生沉淀等，大大降低了蛋白質(zhì)的溶解性，進而影響蛋白的工藝特性，如乳化性、起泡性和凝膠性等。蛋白質(zhì)的去酰胺基化被認為是擴大其利用途經(jīng)和提高其性能的最有前途的方法之一，因為較小程度的脫酰胺作用( 2%~6%)就能顯著提高蛋白的功能特性。脫酰胺改性方法包括物理方法、化學(xué)方法、生物酶法及綜合法�？紫檎涞扔玫蜐舛塞}酸，50℃條件下對小麥蛋白的脫酰胺改性進行了研究。除鹽酸外，磷酸也被用于蛋白質(zhì)脫酰胺改性的研究。近年來，有機酸逐漸被用于蛋白質(zhì)的脫酰胺改性的研究，如檸檬酸。雖然，物理化學(xué)法脫酰胺作用能較好改善蛋白質(zhì)的溶解度，但因反應(yīng)底物的非專一性，常常引起蛋白質(zhì)肽鏈斷裂、改變氨基酸結(jié)構(gòu)以及產(chǎn)生異味等副作用。所以目前多采用作用條件比較溫和且底物專一性強的酶法脫酰胺來達到改善小麥蛋白功能性質(zhì)的目的。一些酶被用于研究和應(yīng)用在蛋白質(zhì)的脫酰胺
上，如蛋白酶、谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶(TG)和肽谷氨酰胺酶等。但TG酶容易引起蛋白質(zhì)交聯(lián)，從而使蛋白質(zhì)不溶性增加。若其過量使用，會對食物造成凝聚等現(xiàn)象。肽谷氨酰胺酶只對分子量低于5 000 D a的多肽的谷氨酰胺酰殘基起作用，對高分子量的多肽和蛋白不發(fā)揮作用且脫酰胺程度不高。蛋白質(zhì)谷氨酰胺酶( Protein-glutaminase，PG)是近年來被廣為研究的一種新型水解酶，因該酶能特異性水解植物蛋白中谷氨酰胺殘基的胺�；�，底物專一性較強，且不會使蛋白質(zhì)產(chǎn)生交聯(lián)作用，在食品工業(yè)中具有十分廣泛的應(yīng)用前景。試驗擬采用谷氨酰胺酶處理谷朊蛋白，得到去酰胺谷朊蛋白，以改善其原有功能性質(zhì)，制備新型小麥改性蛋白產(chǎn)品。通過單因素和正交試驗，分析底物濃度、酶用量、溫度、酶解時間和pH等因素對谷朊蛋白溶解度和脫酰胺度的影響，以獲得谷氨酰胺酶水解小麥蛋白的最佳工藝條件，為小麥蛋白的改性提供技術(shù)支持。
1 材料與方法
1.1材料與試劑
谷朊粉：蛋白質(zhì)含量86.3%，水分11.3%，溶解度3.0%，乳化度8.0%；蛋白質(zhì)谷氨酰胺酶glutaminase( 27.3 U/g)，均購自Sigma公司；其他試劑均為分析純試劑。
1.2儀器與設(shè)備
TV-1901紫外一可見分光光度計、TZS-990原子吸收分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司；Kjeltec TM 3200全自動凱式定氮儀。
1.3方法
1.3.1谷氨酰胺酶改性小麥蛋白的工藝流程
稱取定量谷朊蛋白，邊攪拌邊加入盛有磷酸鹽緩沖溶液( 200 m mol/L，pH 7.0)的恒溫酶反應(yīng)器內(nèi)，形成底物濃度為1%的分散懸濁液，攪拌30 min后加入一定量的蛋白質(zhì)谷氨酰胺酶進行酶解改性反應(yīng)。酶解改性的溫度40℃，pH 7.0，時間為15 h。酶解結(jié)束后，蛋白質(zhì)酶解液用0.1 mol/L的醋酸溶液透析8h，然后將蛋白溶液真空凍干成固體粉末備用。
1.3.2蛋白質(zhì)含量
使用凱氏定氮法測定蛋白質(zhì)含量。
1.3.3脫酰胺度測定：苯酚一次氯酸鹽法
樣品酰胺氮含量的檢測方法采用Conway微量彌散皿法的改進方法。準確稱取0.200 0 g蛋白質(zhì)，加入10m L 3 mol/L鹽酸，密封于硬質(zhì)玻璃燒瓶中，在120℃恒溫條件下水解3h，水解完畢后取出冷卻。取水解溶液做蒸餾，用4%的硼酸溶液接收釋放的氨氣。反應(yīng)結(jié)束后用標準鹽酸滴定，記錄消耗的鹽酸體積。脫酰胺度( DD)由脫酰胺處理后釋放的酰胺基數(shù)目與原蛋白總酰胺基數(shù)目的比值來表示，按公式(1)計算：
1.3.4溶解度的檢測
采用福林酚試劑法測定脫酰胺樣品pH 7.0的溶液中的溶解度。準確稱取凍干樣品( 10 mg)分散于10m L緩沖溶液中，緩沖液是10 m mol/L的磷酸鹽緩沖溶液( pH 7.0)。分散好的蛋白溶液在20℃恒溫條件下攪拌過夜，然后離心30 min(3 000 r/min)，收集上層可溶性組分。從上述收集的溶液中取1 m L用于測定蛋白質(zhì)的溶解度，用牛血清白蛋白做標準曲線。
2結(jié)果與分析
2.1酶與谷朊蛋白質(zhì)量比（E/S）對小麥蛋白酶解工藝的影響
在恒溫酶反應(yīng)器中，以1%谷朊蛋白作底物，谷氨酰胺酶用量分別為0.01，0.02，0.03，0.04，0.05，0.06, 0.08和0.1 U/m L，在40℃、pH 7.0的條件下反應(yīng)15 h。結(jié)果如圖1所示。
由圖1可知，隨著蛋白質(zhì)谷氨酰胺酶用量的增加，谷朊蛋白的脫酰胺度及溶解度逐漸增加，酶用量在0.01～0.05 U/m L之間時，脫酰胺度及溶解度增加很快，當酶用量為0.05 U/m L時，脫酰胺度及溶解度都最高，分別為43.78%和72.23%。隨著酶量的繼續(xù)增加脫酰胺度及溶解度增長緩慢。因此，選定酶用量為0.05U/m L的酶液為最適加酶量。
2.2酸堿度(pH)對小麥蛋白酶解工藝的影響
在恒溫酶反應(yīng)器中，以1%谷朊蛋白作底物，谷氨酰胺酶用量0.05 U/m L，調(diào)節(jié)pH分別為5，5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0和8.5。在40℃、pH 7.0的條件下反應(yīng)15 h。結(jié)果如圖2所示。
由圖2可知，pH對谷朊蛋白酶的脫酰胺度及溶解度都有顯著影響，pH為5.0～7.5時，谷朊蛋白的脫酰胺度及溶解度增長很快，當pH>7.5時，呈緩慢的降低趨勢。當pH 7.0時，脫酰胺度最高，為45.97%;當pH7.5時，溶解度最高，為80.78%。因此，谷氨酰胺酶的最適pH為7.0～7.5。
2.3酶解溫度對小麥蛋白酶解工藝的影響
在恒溫酶反應(yīng)器中，以1%谷朊蛋白作底物，谷氨酰胺酶用量0.05 U/m L，分別在32℃，37 ℃，39℃．43 ℃，45℃，47 ℃，49℃，53℃和55℃等恒溫條件下，pH 7.3，反應(yīng)15 h。結(jié)果如圖3所示。
由圖3可知，隨著酶解溫度的增加，谷朊蛋白的脫酰胺度及溶解度都有顯著變化。當溫度在32℃～47℃時，谷朊蛋白的脫酰胺度及溶解度呈增長趨勢，47℃以后呈緩慢的降低趨勢，可能是由于高溫使酶的活性受到抑制。當酶解溫度在47℃～49 ℃之間，谷朊蛋白的脫酰胺度及溶解度均為最大值，分別為79.81%和44.32%。因此，谷氨酰胺酶的最適酶解溫度在47℃~49℃之間。
2.4酶解時間對小麥蛋白酶解工藝的影響
在恒溫酶反應(yīng)器中，以1%谷朊蛋白作底物，谷氨酰胺酶用量0.05 U/m L，酶解時間分別為3，5，9，13，17，21, 24，26和30 h等，在48℃，pH 7.3條件下反應(yīng)。結(jié)果如圖4所示。
由圖4可知，隨著酶解時間的增加，谷朊蛋白的脫酰胺度及溶解度都有顯著變化。當酶解3～24 h時，谷朊蛋白的脫酰胺度及溶解度呈明顯增長趨勢，24 h以后呈緩慢的降低趨勢。當酶解時間21 h時，脫酰胺度及溶解度均最高，分別為78.64%和43.68%。因此，最佳酶解時間確定為21h。
2.5正交試驗設(shè)計
根據(jù)單因素試驗確定的范圍，選擇酶與底物比、改性溫度、酸堿度( pH)和時間作為考察的4個因素，每個因素3個水平，以脫酰胺度與溶解度為考察指標，用L9(34)正交試驗表安排試驗，得出最佳改性條件。
由表2進行直觀分析，可以看出，谷朊蛋白溶解度的最優(yōu)組合是A2B2C3D2，比較各因素的極差大小為RC>RB>RA>RD，對谷朊蛋白溶解度影響的主次順序為CBAD;谷朊蛋白的脫酰胺度的最優(yōu)組合是A2B2C3D2，比較各因素的極差大小為RD>RB>RC>RA，對脫酰胺度影響的主次順序為DBCA。很明顯，谷朊蛋白溶解度和脫酰胺度的最優(yōu)組合是A2B2C3D2。
由于A2B2C3D2組合不在試驗之內(nèi)，所以補加驗證試驗A2B2C3D2組合。按優(yōu)選工藝組合A2B2C3D2試驗3次，結(jié)果表明，谷朊蛋白溶解度為82.36%，脫酰胺度為45.76%，優(yōu)于正交試驗中的任何一個組合，故確定A2B2C3D2為最優(yōu)的谷氨酰胺酶最優(yōu)的水解小麥蛋白工藝條件。
3結(jié)論
谷朊蛋白為原料，使用蛋白質(zhì)谷氨酰胺酶對其進行酶解改性。以溶解度、脫酰胺度為考察指標，通過單因素及正交試驗，對蛋白質(zhì)谷氨酰胺酶酶解改性谷朊蛋白進行了工藝條件的優(yōu)化，分別研究了蛋白質(zhì)谷氨酰胺酶與谷朊蛋白質(zhì)量比、酶解溫度、酶解時間和酶解pH等4個工藝參數(shù)對酶解改性谷朊蛋白溶解度及脫酰胺度的影響，確定了蛋白質(zhì)谷氨酰胺酶解改性小麥蛋白的最佳工藝條件：谷氨酰胺酶與谷朊蛋白質(zhì)量比0.05：1，酶解溫度45℃，酶解時間26 h，酶解pH7.3。在此酶解條件下，谷朊蛋白溶解度為82.36%，脫酰胺度為45.76%。
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