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 羅李王，楊最素，張亞茹，王飛，余方苗*，丁國芳

 浙江海洋學(xué)院食品與醫(yī)藥學(xué)院，浙江省海洋生物醫(yī)用制品工程技術(shù)研究中心（舟山316022）

摘要研究酶解青蛤制備血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(Angiotensin-converting enzyme, ACE)抑制肽。以ACE抑制率為指標(biāo)，先篩選最適酶種；探究溫度、時間、pH、加酶量和料液比等因素對ACE活性的影響，通過L16(45)正交試驗(yàn)優(yōu)化酶解工藝。結(jié)果表明，最適酶為胰蛋白酶，最佳制備工藝條件為：反應(yīng)溫度45℃，反應(yīng)時間9h，pH 8.0，加酶量1 200U/g，料液比為1：2(g/mL)。最佳工藝所得酶解物的ACE抑制率為36.8%。為青蛤的高值化利用提供了理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞  青蛤；酶解；血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽；單因素試驗(yàn)；正交試驗(yàn)

  高血壓是困擾當(dāng)今的一種心血管疾病，可導(dǎo)致嚴(yán)重的并發(fā)癥，對人類健康危害極大。血管緊張素轉(zhuǎn)化酶( Angiotensln-converting enzyme，ACE)在機(jī)體血壓調(diào)節(jié)過程中起重要作用，一方面ACE將無活性的血管緊張素I轉(zhuǎn)化為具有強(qiáng)烈收縮全身微動脈，使血壓升高的血管緊張素Ⅱ；另一方面ACE能促進(jìn)有降血壓作用的緩激肽分解，引起血壓升高�，F(xiàn)今人工合成的卡托普利、依那普利和賴諾普利等ACE抑制劑，這些藥物具有很強(qiáng)的降血壓作用，但長期服用會產(chǎn)生眩暈、惡心、劇烈咳嗽、味覺異常和腎功能損害等副作用。因此，開發(fā)既有較好ACE抑制活性且安全無毒副作用的產(chǎn)品成為研究的熱點(diǎn)。

 近年來，研究者將目光投向了包括海洋貝類、魚類以及海產(chǎn)品加工下腳料等海洋蛋白為原料制備ACE抑制肽，并取得了一定的進(jìn)展。目前，已經(jīng)成功的從貽貝、四角蛤蜊、墨魚肌肉、鱈魚皮、金槍魚骨和灰鰩皮等海洋蛋白中制備分離出高活性的ACE抑制肽。

 青蛤（Cyclina sinensis）是我國沿海常見的貝類，屬軟體動物門、雙殼鋼、簾蛤目、簾蛤科。青蛤提取物具有抗氧化、抗腫瘤和提高機(jī)體免疫作用等功效。目前尚鮮見與青蛤降血壓肽相關(guān)的研究報道，試驗(yàn)在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用正交試驗(yàn)對胰蛋白酶水解青蛤制備ACE抑制肽的工藝進(jìn)行優(yōu)化。為進(jìn)一步從青蛤中制備、分離純化得到高活性的抑制肽做準(zhǔn)備。

1  材料與方法

1.1原料

  青蛤：市售，并經(jīng)浙江海洋學(xué)院趙盛龍教授鑒定。

1.2試劑

 馬尿酸、馬尿酰-組氨酰-亮氨酸( HHL)和血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（源于兔肺）：Sigma公司；乙腈、甲醇：色譜純；三氟乙酸、硼酸、硼砂、氯化鈉：分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；胰蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶：亞太恒信生物科技有限公司。

1.3儀器與設(shè)備

 Agilent-1260型高效液相色譜儀：美國安捷倫公司；Milli-A20型超純水系統(tǒng)：美國默克密理博公司；AUW-120型電子天平：日本島津（上海）有限公司；Delta-320型pH計：梅特勒托利多儀器（上海）有限公司；HH-6型恒溫水浴鍋：金壇市成輝儀器有限公司；CF16RN型高速冷凍離心機(jī)：日立儀器有限公司。

1.4試驗(yàn)方法

1.4.1青蛤ACE抑制肽制備工藝流程

1.4.2青蛤預(yù)處理

 將青蛤除殼，剝?nèi)�，再用清水把蛤肉洗干凈，�?jīng)高速組織攪碎機(jī)勻漿( 10 000 r/min，5 min)。用0.1 mol/L的NaOH浸泡青蛤肉3h，脫雜蛋白和除去脂質(zhì)，試驗(yàn)重復(fù)2次，最后用紗布濾去NaOH，純水泡洗濾渣（直至中性），濾渣脫水-20℃冷凍備用。

1.4.3高效液相色譜(HPLC)法測ACE抑制活性

 參HaShanguang Wu等舊的方法，并根據(jù)試驗(yàn)的具體情況稍作修改。試驗(yàn)在1.5 mL的離心管中進(jìn)行，取濃度為5 mmol/L的HHL溶液120μL，加入20 μL抑制劑(1 mg/mL)，混合均勻，在37 0C恒溫水浴中預(yù)熱5 min，然后加入10μL ACE( 0.1 U/mL)溶液，混合均勻，在37℃恒溫水浴1h，最后加入150μL HC1(1 mol/L)終止反應(yīng)，得到抑制劑反應(yīng)液。所得樣品溶液經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾，進(jìn)樣到液相系統(tǒng)。同時用20μL硼酸緩沖鹽溶液（0.1 moI/L，pH 8.3，含0.3mol/L NaCl）替代抑制劑溶液作空白對照組。

ACE抑制活性計算公式為：

1.4.4酶解方法

 稱取預(yù)處理的青蛤肉( 10 g)，以胰蛋白酶為例，在溫度為50℃、pH 8.0、加酶量為1 000 U/g、料液比1：3( g/mL)時酶解反應(yīng)6h，用0.5 moI/L Na OH溶液或0.5 mol/L HC1調(diào)節(jié)pH至酶解條件，水解過程中不斷攪拌，并維持pH在規(guī)定的范圍內(nèi)(±0.05)，反應(yīng)完成后于沸水浴滅活15 min，冷卻后于4℃．10 000 r/min預(yù)冷的離心機(jī)離心15 min，上清液冷凍干燥后備用，測其ACE抑制活性。

1.4.5酶解工藝優(yōu)化

 先通過選酶單因素試驗(yàn)篩選最佳酶，再做溫度、時間、pH、加酶量和料液比等單因素試驗(yàn)，選取合理因素水平，最后通過L16(45)正交試驗(yàn)優(yōu)化酶解青蛤制備ACE抑制肽工藝。

2結(jié)果與分析

2.1篩選最佳酶

 稱5份10 g預(yù)處理的青蛤肉，分別用胰蛋白酶、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶和胃蛋白酶，按照各蛋白酶的最適作用溫度和pH（見表1），參照1.4.3的酶解方法進(jìn)行酶解，以ACE抑制率作為評價指標(biāo)，結(jié)果見圖1。

 由圖1可知，在所選的5種蛋白酶中，胃蛋白酶酶解物的ACE抑制活性最弱；堿性蛋白酶、中性蛋白酶和木瓜蛋白酶酶解物的ACE抑制活性一般；胰蛋白酶酶解物的ACE抑制活性最強(qiáng)，抑制率為32.8%；由于這五種蛋白酶的作用方式和酶切位點(diǎn)均不相同，所以作用于同一底物后，得到的酶解產(chǎn)物也不同。因此，試驗(yàn)對胰蛋白酶酶解青蛤制備ACE抑制肽的條件進(jìn)行優(yōu)化。

2.2胰蛋白酶解單因素試驗(yàn)

2.2.1  溫度單因素試驗(yàn)

 分別稱5份10 g預(yù)處理的青蛤肉，調(diào)節(jié)pH至8.0，加酶量為1 000 U/g，料液比為1：3(g/mL)，在不同溫度下（40℃, 45℃，50 ℃，55 ℃和60℃）酶解6h。結(jié)果如圖2所示。

 從圖2可以看出，在酶解過程中，適當(dāng)?shù)奶岣邷囟瓤稍黾用附猱a(chǎn)物對ACE的抑制活性；在50℃時酶解產(chǎn)物對ACE的抑制活性達(dá)到峰值，抑制率為32.44%：溫度大于50℃時，酶解產(chǎn)物的ACE抑制活性開始減弱。綜合考慮后，酶解溫度選擇400C～55 0C的水平做正交試驗(yàn)。

2.2.2時間單因素試驗(yàn)

 分別稱5份10 g預(yù)處理的青蛤肉，料液比為1：3( g/m L)，加酶量為1 000 U/g，反應(yīng)pH為8.0，50℃恒溫酶解（2，4，6，8和10 h）。結(jié)果如圖3所示。

 從圖3可以看出，隨反應(yīng)時間適當(dāng)延長酶解產(chǎn)物對ACE抑制活性逐漸上升，酶解反應(yīng)時間為8h時酶解產(chǎn)物對ACE抑制活性達(dá)到峰值，抑制率為32.66%。隨酶解時間的增加，活性肽段逐漸被釋放，但酶解時間過長會使目的產(chǎn)物被降解，造成ACE抑制活性下降。綜合考慮后，酶解時間選擇7～10 h的水平做正交試驗(yàn)。

2.2.3 pH單因試驗(yàn)

 分別稱5份10 g預(yù)處理的青蛤肉，加酶量為1 000U/g，反應(yīng)溫度為50 0C，料液比為1：3(g/m L)，在不同pH（6，7，8，9和10）下酶解6h。結(jié)果如圖4所示。

 從圖4可以看出，在pH為6～10時，隨反應(yīng)pH的增大酶解產(chǎn)物對ACE抑制活性先升后降。酶有最佳酶解pH，過酸或過堿都會影響酶的活性。pH為8時酶解產(chǎn)物對ACE抑制活性達(dá)到峰值，抑制率為33.65%。綜合考慮后，酶解pH選擇6～9的水平做正交試驗(yàn)。

2.2.4加酶量單因素試驗(yàn)

 分別稱5份10 g預(yù)處理的青蛤肉，調(diào)節(jié)pH至8.0，在加酶量為（300，600，900，1 200和1 500 U/g）的條件下，50℃恒溫酶解6 h。結(jié)果如圖5所示。

 從圖5可以看出，在酶解的過程中隨著加酶量的增加酶解產(chǎn)物對ACE抑制率逐漸上升，在600～900 U/g之間，增幅較大，此后隨加酶量的增加，ACE抑制率增幅較小，這種現(xiàn)象可能是酶濃度達(dá)到了飽和狀態(tài)。當(dāng)加酶量為1 500 U/g時，酶解物的ACE抑制活性最強(qiáng)，抑制率為30.2%。隨著加酶量的增加，酶解的不良?xì)馕都又�，綜合考慮后，加酶量選擇800～1 400 U/g的水平做正交試驗(yàn)。

2.2.5料液比單因素試驗(yàn)

 分別稱5份10 g預(yù)處理的青蛤肉，調(diào)節(jié)pH至8.0，加酶量為1 000 U/g，在不同的料液比(1:1，1：2，1：3，1：4和1：5(g/m L))的條件下，50℃恒溫酶解6h。結(jié)果如圖6所示。

 從圖6可以看出，在酶解的過程中隨著料液比的增加酶解產(chǎn)物對ACE抑制率先升后降再升；在料液比為1：2( g/m L)時，酶解產(chǎn)物對ACE抑制活性達(dá)到峰值，抑制率為34.21%。綜合考慮后，料液比選擇1：2～1：5(g/m L)的水平做正交試驗(yàn)。

2.3胰蛋白酶解正交試驗(yàn)

2.3.1正交試驗(yàn)因素水平的選取

 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，獲得較好的試驗(yàn)參數(shù)范圍后，綜合考慮各因素之間的相互影響，選擇酶解溫度、加酶量、pH、時間和料液比5個因素進(jìn)行優(yōu)化，每個因素4AI水平。試驗(yàn)因素和水平設(shè)計見表2。

2.3.2正交試驗(yàn)設(shè)計及結(jié)果

  選擇各單因素的合理水平做L16(45)正交試驗(yàn)，以確定胰蛋白酶酶解青蛤制備ACE抑制肽的最佳條件。L16(45)正交試驗(yàn)的結(jié)果如表3。

  由表3結(jié)果作極差分析可知，5個因素的極差大小為：A>C>B>E>D。即反應(yīng)過程中以料液比影響最大，其次為加酶量、pH、時間，最后為溫度。根據(jù)極差大小可知最優(yōu)組合為A1C3B3E3D2，即料液比為1：2( g/mL)，加酶量為1 200 U/g，pH為8.0，反應(yīng)時間為9 h，反應(yīng)溫度為45℃。在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證，酶解產(chǎn)物對ACE的抑制率36.8%，為最優(yōu)試驗(yàn)結(jié)果。

3結(jié)論

 以青蛤?yàn)樵�料酶解法制備ACE抑制肽。以ACE抑制活性為指標(biāo)，先篩選最適酶種，確定最適酶為胰蛋白酶。在溫度、時間、pH、加酶量和料液比單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上通過L16(45)正交試驗(yàn)優(yōu)化酶解工藝。最佳制備工藝條件：料液比1:2（g/m L），加酶量1 200U/g，pH 8.0，反應(yīng)時間9h，反應(yīng)溫度為45 0C，最佳工藝下酶解物的ACE抑制率為36.8%。該工藝為進(jìn)一步試驗(yàn)提供了基礎(chǔ)，也為開發(fā)海洋生物酶解制備ACE抑制肽提供思路。