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 周皓東，周艷，劉麗萍，夏剛強(qiáng)，韋策，張紅漫*

 南京工業(yè)大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院（南京211800）

摘要選用5種商品化果聚糖替換合成培養(yǎng)基中的葡萄糖，對(duì)兩歧雙歧桿菌進(jìn)行體外培養(yǎng)，通過(guò)測(cè)量發(fā)酵液中OD值及pH的變化，考察了5種商品化果聚糖對(duì)兩歧雙歧桿菌體外生長(zhǎng)的影響。結(jié)果表明，低聚果糖與菊粉對(duì)兩歧雙歧桿菌均有顯著的促生長(zhǎng)作用，且組成不同的果聚糖對(duì)兩歧雙歧桿菌的體外生長(zhǎng)有著不同的影響。其中，保齡寶與青海威德公司生產(chǎn)的低聚果糖，其對(duì)兩歧雙歧桿菌的促生長(zhǎng)作用分別為葡萄糖的2.71倍及1.96倍：青海威德與比利時(shí)Orafti公司菊粉的促生長(zhǎng)作用分別為葡萄糖的2.78倍及1.64倍：而Orafti公司的多聚果糖對(duì)這一菌株未呈現(xiàn)出明顯的促生長(zhǎng)作用。

關(guān)鍵詞  低聚果糖；菊粉；多聚果糖；兩歧雙歧桿菌：體外生長(zhǎng)

 人體內(nèi)腸道菌群的均衡對(duì)于維持人體健康有著非常重要的作用，如何促進(jìn)腸道內(nèi)有益菌群如雙歧桿菌、乳酸菌等的生長(zhǎng)已經(jīng)成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。以果聚糖等為代表的益生元，進(jìn)人人體后可逃逸消化道的消化，以原形在結(jié)腸內(nèi)被雙歧桿菌等益生菌發(fā)酵利用，從而選擇性地促進(jìn)其生長(zhǎng)，因而具有抵御病原微生物侵襲，降低腸道pH，促進(jìn)微量元素吸收及骨骼生長(zhǎng)，以及預(yù)防結(jié)腸癌等功效。由于果聚糖所含聚糖的聚合度不同，一般分為低聚果糖、菊粉及多聚果糖。低聚果糖，又稱為果寡糖，聚合度在2～9之間。其來(lái)源主要有兩種：一是以蔗糖為原料，通過(guò)酶法進(jìn)行分子內(nèi)果糖苷轉(zhuǎn)移反應(yīng)生成的蔗果型低聚果糖；二是以菊芋、菊苣為原料提取的菊粉，經(jīng)酶解或酸解后形成的果型為主的低聚果糖。菊粉是一種由D-呋

喃果糖分子以β (2→1)糖苷鍵連接而成的果聚糖混合物，聚合度通常在2～60之間，由菊芋、菊苣等原料經(jīng)熱水提取而成。國(guó)外主要以菊苣為原料生產(chǎn)菊粉，而國(guó)內(nèi)多以菊芋為原料生產(chǎn)。多聚果糖的結(jié)構(gòu)與菊粉相似，但聚合度通常在30以上，可從菊粉中分離制得。

 由于目前對(duì)組成不同的商品化果聚糖的益生元效果研究不多，同時(shí)現(xiàn)有研究中多采用天然培養(yǎng)基來(lái)培養(yǎng)，由于天然培養(yǎng)基的組分較復(fù)雜，往往反映不出果聚糖的真實(shí)效果；而合成培養(yǎng)基由于碳源組成單一明確，進(jìn)行果聚糖碳源替代后效果明顯。鑒于此，選取了5種商品果聚糖替換合成培養(yǎng)基中的葡萄糖碳源，并以葡萄糖碳源作為對(duì)照，比較了5種商品果聚糖對(duì)兩歧雙歧桿菌體外生長(zhǎng)的影響，旨在為相關(guān)領(lǐng)域的研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1  材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

 兩歧雙歧桿菌AB 20402:中國(guó)典型培養(yǎng)物菌種保藏中心；低聚果糖：保齡寶生物股份有限公司、青海威德生物技術(shù)有限公司；菊粉：比利時(shí)Orafti公司、青海威德生物技術(shù)有限公司；多聚果糖：比利時(shí)Orafti公司。5種樣品分別記為低聚果糖（保）、低聚果糖（威）、菊粉( Or)、菊粉（威）及多聚果糖(Or)。

1.2儀器與設(shè)備

 YX280A*手提式不銹鋼壓力蒸汽滅菌器：上海三申醫(yī)療器械有限公司；VD-850型桌上式潔凈工作臺(tái)：蘇州凈化設(shè)備有限公司；THZ-D臺(tái)式恒溫振蕩器：太倉(cāng)市強(qiáng)樂(lè)實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；DHP 9032電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；PHS-25型數(shù)顯酸度計(jì)：杭州齊威儀器有限公司；UV1800紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海美譜達(dá)儀器有限公司。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1樣品分析

 樣品中水分含量按照國(guó)標(biāo)GB/T 23528方法測(cè)定；方法，首先用DNS法測(cè)定樣品中的還原糖含量，然后用苯酚硫酸法測(cè)定其總糖含量，利用總糖與還原糖含量之差計(jì)算樣品中的聚糖含量。

 高效液相分析條件（Waters 2695色譜儀）：Waters Xbridge Amid色譜柱；流動(dòng)相采用梯度洗脫模式，30 min內(nèi)乙腈與水的配比從75：25變?yōu)?0：50，之后保持不變；流速1 m L/min。

1.3.2培養(yǎng)基

1.3.2.1  活化培養(yǎng)基

 活化培養(yǎng)基由中國(guó)典型培養(yǎng)物菌種保藏中心提供。

1.3.2.2基礎(chǔ)培養(yǎng)基

 葡萄糖1g，氯化鈉5g，硫酸鎂(MgSO4.7H2O)0.2 g，磷酸二氫銨1g，磷酸氫二鉀1 g，蒸餾水1 L，pH 6.5，

1.3.2.3試驗(yàn)培養(yǎng)基

 將基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的葡萄糖用5種果聚糖樣品按同等比例替換。

1.3.3菌種活化

 兩歧雙歧桿菌凍干粉經(jīng)無(wú)菌水溶解后，接種到20mL活化培養(yǎng)基中，37℃靜置培養(yǎng)24 h。吸取200μ L菌懸液于20 m L活化培養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng)24 h。經(jīng)兩次活化后，制成菌懸液。

1.3.4果聚糖對(duì)兩歧雙歧桿菌體外生長(zhǎng)的影響

  將菌懸液按1%的接種量分別接種于基礎(chǔ)培養(yǎng)基與試驗(yàn)培養(yǎng)基中，通氬氣除氧后，37℃搖床培養(yǎng)，考察48 h內(nèi)菌株的生長(zhǎng)情況。以培養(yǎng)基的OD600nm繪制生長(zhǎng)曲線，測(cè)量培養(yǎng)基中的pH繪制酸度變化曲線，對(duì)比穩(wěn)定期基礎(chǔ)培養(yǎng)基與試驗(yàn)培養(yǎng)基的OD600nm。

2結(jié)果與討論

2.1樣品分析

  參照GB/T 23528（低聚果糖國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)）規(guī)定，樣品含水量應(yīng)為5% 以下，從表1可見(jiàn)，5種樣品的含水量均達(dá)標(biāo)。同時(shí)，根據(jù)還原糖和總糖的測(cè)定結(jié)果計(jì)算，5種樣品的聚糖含量均在89%以上，可滿足試驗(yàn)要求作為培養(yǎng)兩歧雙歧桿菌的碳源。

 圖1的高效液相圖譜揭示了5種商品果聚糖在組成上的差異。保齡寶公司的低聚果糖組成比較簡(jiǎn)單，兩個(gè)主組分分別在16和19 min的位置出峰。比較而言，青海威德公司的低聚果糖組分相對(duì)較多，在7～25 min的出峰時(shí)間可見(jiàn)多個(gè)組分。其原因可能是保齡寶的低聚果糖以蔗糖為原料，經(jīng)酶法反應(yīng)生成的蔗果型果聚糖組成比較單一。威德的低聚果糖是以菊芋為原料提取的菊粉經(jīng)酶解后制得的，因而組成相對(duì)比較復(fù)雜。從Orafti公司與青海威德公司生產(chǎn)的菊粉組成來(lái)看，兩種產(chǎn)品的組成均較低聚果糖更為復(fù)雜，Orafti菊粉的組分出峰時(shí)間主要集中在6～40 min，威德菊粉的組分出峰時(shí)間主要集中在10～33 min。其組成的差異主要是因?yàn)镺rafti菊粉以菊苣為原料生產(chǎn)，而威德菊粉以菊芋為原料提取而得。圖1中也可以看到，多聚果糖由于聚合度比較高，分離比較困難，出峰時(shí)間主要集中在30～40 min，且其峰型較差。

2.2果聚糖對(duì)兩歧雙歧桿菌體外生長(zhǎng)的影響

 圖2為兩歧雙歧桿菌在葡萄糖及5種商品果聚糖為碳源下的生長(zhǎng)曲線�？梢钥闯�，0～12 h為菌體生長(zhǎng)的適應(yīng)期，在此期間菌體生長(zhǎng)緩慢，不同碳源未表現(xiàn)出明顯區(qū)別。12～40 h，菌體進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，此階段菌體生長(zhǎng)迅速，且在不同碳源體系呈現(xiàn)出了顯著的差異。圖2中可見(jiàn)，與葡萄糖碳源相比，保齡寶的低聚果糖與青海威德的菊粉對(duì)兩歧雙歧桿菌的促生長(zhǎng)作用最為明顯，其生長(zhǎng)速率明顯高于其他各組；其次為青海威德的低聚果糖與Orafti的菊粉，兩歧雙歧桿菌在此兩種碳源中的生長(zhǎng)速率均明顯高于葡萄糖碳源中的生長(zhǎng)速率；多聚果糖碳源未表現(xiàn)出對(duì)兩歧雙歧桿菌的促生長(zhǎng)作用，其生長(zhǎng)速率甚至稍遜于葡萄糖碳源，可能是由于多聚果糖聚合度較高，菌株難以利用的原因。這一結(jié)論也與文獻(xiàn)報(bào)道相一致，但多聚果糖由

于聚合度較高，在脂肪替代及緩解便秘等方面有其特殊應(yīng)用。40 h后菌株進(jìn)入生長(zhǎng)穩(wěn)定期，不同碳源下的OD600nm均趨于穩(wěn)定。對(duì)比發(fā)酵40 h兩歧雙歧桿菌在不同碳源中的生長(zhǎng)情況（圖3），與葡萄糖碳源相比，保齡寶與青海威德公司的低聚果糖對(duì)兩歧雙歧桿菌的促生長(zhǎng)作用分別為葡萄糖的2.71倍和1.96倍；青海威德與Orafti公司菊粉的促生長(zhǎng)作用分別為葡萄糖的2.78倍和1.64倍; Orafti公司的多聚果糖未顯示出對(duì)兩歧雙歧桿菌的促生長(zhǎng)作用，其生長(zhǎng)速率僅為葡萄糖的88%。

  腸道菌群中的雙歧桿菌、乳酸菌等益生菌在利用果聚糖碳源發(fā)酵時(shí)會(huì)產(chǎn)生更多的短鏈脂肪酸，使環(huán)境的pH降得更低。這些短鏈脂肪酸不僅對(duì)營(yíng)養(yǎng)腸上皮細(xì)胞，抵御病原微生物侵襲具有積極作用，同時(shí)可促進(jìn)骨骼生長(zhǎng)，調(diào)節(jié)血脂以及降低結(jié)腸癌的發(fā)病率。試驗(yàn)跟蹤了兩歧雙歧桿菌在不同碳源發(fā)酵過(guò)程中體系pH的變化，從圖4可見(jiàn)，隨著發(fā)酵時(shí)間的增加，pH變化呈現(xiàn)出與生長(zhǎng)曲線相一致的變化規(guī)律：在0～12 h的菌體生長(zhǎng)適應(yīng)期，體系pH基本保持不變；在12～40 h的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，pH變化明顯，與葡萄糖碳源相比，低聚果糖和菊粉碳源均使體系的pH下降更多，約低0.3個(gè)pH單位。而多聚果糖碳源體系的pH在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中均變化不明顯，可能與其聚合度較高有關(guān)；至40 h后的生長(zhǎng)穩(wěn)定期，不同碳源體系的pH均趨于穩(wěn)定。

3結(jié)論

 考察了5種不同組成的商品果聚糖對(duì)兩歧雙歧桿菌體外生長(zhǎng)的影響。結(jié)果表明，低聚果糖和菊粉均表現(xiàn)出了明顯的促生長(zhǎng)作用，而多聚果糖由于聚合度較高未呈現(xiàn)出對(duì)菌株的增殖效果。其中，保齡寶公司的低聚果糖與青海威德公司的菊粉對(duì)兩歧雙歧桿菌的促生長(zhǎng)效果最好，與葡萄糖碳源相比，增殖能力分別達(dá)到2.71倍及2.78倍。由于果聚糖組成比較復(fù)雜，不同原料來(lái)源及不同生產(chǎn)工藝等均會(huì)帶來(lái)差異，同時(shí)菌株對(duì)果聚糖的利用也是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，不同菌株間也存在差異，還有很多問(wèn)題值得深入研究。研究結(jié)果為不同組成的商品果聚糖的應(yīng)用提供了參考。