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 葉茂，鄧毛程

1．廣東輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品與生物工程系（廣州510300）；2．廣東高校特色調(diào)味品工程技術(shù)開(kāi)發(fā)中心（廣州510300）

摘要試驗(yàn)以農(nóng)產(chǎn)品加工廢棄物為主要原料，采用響應(yīng)面法對(duì)1株高產(chǎn)氨肽酶的米曲霉Y-15固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酶條件進(jìn)行優(yōu)化。應(yīng)用Plackett- Burman試驗(yàn)篩選出三個(gè)重要影響因子：麥麩、豆粕和水，中心組合響應(yīng)面試驗(yàn)對(duì)重要影響因子進(jìn)一步優(yōu)化，最終確定產(chǎn)酶培養(yǎng)條件為麥麩179.8g豆粕為191.6 g，水的添加量為386 g，在此條件下，氨肽酶的酶活力達(dá)到2 879.67 U/g。該米曲霉的培養(yǎng)基成分為農(nóng)業(yè)加工廢棄物，極大降低生產(chǎn)成本，具有一定的生產(chǎn)研究?jī)r(jià)值。

  關(guān)鍵詞  米曲霉；氨肽酶；固態(tài)發(fā)酵；優(yōu)化；響應(yīng)面分析

  氨肽酶是一類從多肽鏈的N端順序水解氨基酸、使氨基酸逐個(gè)游離出來(lái)的水解酶，其底物作用范圍一般較為廣譜，不僅能夠水解多肽，而且能水解完整的蛋白質(zhì)分子。氨肽酶主要應(yīng)用于食品工業(yè)中：當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)大分子酶解時(shí)，肽鏈中含有的疏水性氨基酸暴露出來(lái)，接觸味蕾而呈現(xiàn)苦味，而這些疏水性氨基酸一般位于肽鏈末端，而利用氨肽酶進(jìn)一步水解蛋白質(zhì)水解液，可以脫除其苦味；與蛋白酶復(fù)合使用，在醬油釀造、魚露生產(chǎn)及其它蛋白水解產(chǎn)品的制備過(guò)程中，不僅可以提高蛋白質(zhì)的利用率，而且能形成風(fēng)味獨(dú)特、滋味鮮美的復(fù)合氨基酸水解液。

 氨肽酶不僅存在于高等動(dòng)物的胰臟、腸液中，也廣泛分布于多種植物、真菌、細(xì)菌和原生動(dòng)物體內(nèi)，其中對(duì)于真菌氨肽酶的結(jié)構(gòu)、功能、調(diào)控機(jī)制和生產(chǎn)應(yīng)用等方面已經(jīng)進(jìn)行了較為廣泛和深入的研究。目前，國(guó)外已有通過(guò)曲霉發(fā)酵生產(chǎn)氨肽酶，實(shí)現(xiàn)了氨肽酶酶制劑商品供應(yīng)，國(guó)內(nèi)氨肽酶發(fā)酵生產(chǎn)及應(yīng)用方面的研究仍處于起步的階段。米曲霉（Aspergillus oryzae）作為氨肽酶的重要生產(chǎn)菌之一，其發(fā)酵工藝條件已經(jīng)得到了研究，但主要采用的是液態(tài)發(fā)酵

法。而固態(tài)發(fā)酵法具有培養(yǎng)基簡(jiǎn)單且來(lái)源廣泛、能耗低、環(huán)境污染較少的優(yōu)點(diǎn)，并且固態(tài)發(fā)酵更有利于曲霉的生長(zhǎng)繁殖和產(chǎn)酶。因此如何實(shí)現(xiàn)氨肽酶的規(guī)�；�生產(chǎn)、降低成本來(lái)滿足商業(yè)化的需要，對(duì)于提高我國(guó)的相關(guān)產(chǎn)業(yè)發(fā)展水平具有重要意義。試驗(yàn)是在前期試驗(yàn)篩得到的高產(chǎn)氨肽酶米曲霉Y-15的基礎(chǔ)上，利用農(nóng)業(yè)加工的副產(chǎn)品進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵法，初步研究其產(chǎn)酶發(fā)酵工藝條件，以提高該菌株氨肽酶產(chǎn)酶水平，降低生產(chǎn)成本，為進(jìn)一步研究利用提供參考。

1  材料與方法

1.1材料

1.1.1菌種

 米曲霉（A．oryzae）Y-15：實(shí)驗(yàn)室從醬油曲種中篩選獲得，斜面保藏于4 0C冰箱。

1.1.2材料與試劑

 碳源（麩皮、甘蔗渣、米糠、木屑）和氮源（豆粕、花生粕、菜籽油餅、玉米粉）：市售；氨肽酶底物（L-亮氨酸-p -對(duì)硝基苯胺）：美國(guó)Sigma-Aldrich公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.3主要儀器與設(shè)備

 SW-CJ-ZFD型雙人單面凈化工作臺(tái)：蘇州凈化設(shè)備有限公司；DHP-9162型電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；722N型可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.2方法

1.2.1  出發(fā)菌株的活化

  將米曲霉菌株接種于馬鈴薯( PDA)培養(yǎng)基進(jìn)行活化，30℃培養(yǎng)3～4 d，待長(zhǎng)滿黃綠色孢子后備用。

1.2.2單孢子懸液的制備

  取培養(yǎng)好的斜面，用無(wú)菌生理鹽水洗脫孢子后轉(zhuǎn)移至裝有玻璃珠的無(wú)菌錐形瓶中，充分搖動(dòng)使孢子散開(kāi)，用帶脫脂棉的無(wú)菌漏斗過(guò)濾除去菌絲得到孢子懸液，將孢子濃度調(diào)整到5×106個(gè)/m L備用。

1.2.3  固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)

  稱重500～1 000 g的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基置于金屬托盤( 120 cm×100 cm×10 cm)，培養(yǎng)基的配方根據(jù)單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面分析試驗(yàn)設(shè)計(jì)，通過(guò)添加鹽酸和氫氧化鈉水溶液來(lái)調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的初始pH和水分，然后121℃高壓蒸汽滅菌20 min，待培養(yǎng)基冷卻到室溫，將1 m L的5 x 106個(gè)/m L的孢子懸液接種到固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中，在30℃下，保持相對(duì)濕度在85%，恒溫培養(yǎng)3d。所有的試驗(yàn)都是平行3次。

1.2.4粗酶液的提取

  分別稱取10 g成曲，研磨后加入100 m L蒸餾水，40℃浸提1h，其間攪拌2～3次。根據(jù)不同酶活力測(cè)定所需的緩沖液分別定容到合適的稀釋度，用中速定性濾紙過(guò)濾，濾液即為粗酶液。同時(shí)測(cè)定曲料水分，酶活力用曲料干基重量表示，即U/g。

1.2.5氨肽酶活力的測(cè)定方法

  采用L-亮氨酸-p-對(duì)硝基苯胺為底物測(cè)定。

1.3數(shù)據(jù)處理

  所有數(shù)據(jù)用Design-Expert 8.07軟件進(jìn)行分析。

2結(jié)果與分析

2.1單因素試驗(yàn)

  采用單次單因素法，假設(shè)各因素間不存在交互作用，1次改變培養(yǎng)基的1個(gè)因素的水平而其他因素保持不變，然后逐個(gè)進(jìn)行考察優(yōu)化，作為Plackett -Burman試驗(yàn)的準(zhǔn)備。

  結(jié)果表明，當(dāng)碳源為麥麩時(shí)，氨肽酶的固態(tài)發(fā)酵酶活力最高(1960±120 U/g)，其它依次為米糠(1230±150 U/g)、甘蔗渣（1026土118 U/g）和木屑( 913±80 U/g)；當(dāng)?shù)�源為豆粕時(shí)，氨肽酶的酶活力最高（2 012±43 U/g），其它依次為玉米粉（1796±108 U/g）、花生粕（1 320±160 U/g）和菜籽油餅（1100土78 U/g）；無(wú)機(jī)鹽中的Na Cl和K2PO3對(duì)氨肽酶的固態(tài)發(fā)酵酶活力有正相關(guān)性，其它的MgSO4、MnSO4、H2O、FeCI3．H2O和CaCl2則沒(méi)有影響；接種量為2%時(shí)，氨肽酶的固態(tài)發(fā)酵酶活力達(dá)到最高(2 004 ±116 U/g)；初始pH為7.0時(shí)，氨肽酶的固態(tài)發(fā)酵酶活力最高（2 060±88 U/g）；水分含量為50%時(shí)，氨肽酶的固態(tài)發(fā)酵酶活力最高(2 160±90U/g)。

2.2 Plackett-Burman設(shè)計(jì)試驗(yàn)確定顯著因素

 在上述單因素試驗(yàn)結(jié)果優(yōu)化的基礎(chǔ)上，利用Plackett-Burman設(shè)計(jì)試驗(yàn)分析米糠（X1）、麩皮（X2）、Na CI（X3）、K2PO3（X4）、玉米粉（X5）、豆粕（X6）、pH（X7）、接種量（X8）和水分（X9）等9個(gè)因素的顯著性，每個(gè)因素取2個(gè)水平(見(jiàn)表1)。并運(yùn)用軟件進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次，對(duì)應(yīng)的響應(yīng)值取平均值，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表2。

 對(duì)Plackett-Burman試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)果如表3所示。影響米曲霉Y-15固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)氨肽酶的顯著因素分別是麩皮（X2; p=0.014）、豆粕(X6)；p=0.021)和水分（X9；p=0.032）．均小于0.050，可以作為進(jìn)一步優(yōu)化的因素，其他因素對(duì)結(jié)果影響不大，在進(jìn)一步研究中，取中間水平，對(duì)影響效果不進(jìn)行分析。此外，回歸方程的系數(shù)R2=0.988 4，調(diào)整后R2Adj =0.936 1，表明多項(xiàng)式模型擬合較好。

2.3最陡爬坡試驗(yàn)

 根據(jù)Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果，顯著因素豆粕（X6）對(duì)酶活力表現(xiàn)為正效應(yīng)，顯著麩皮（X2）和水分（X9）對(duì)酶活力表現(xiàn)為負(fù)效應(yīng)，根據(jù)這3個(gè)顯著影響因素效應(yīng)的大小確定試驗(yàn)的爬坡方向和變化步長(zhǎng)，以最快的速度逼近最大響應(yīng)值（酶活力）的區(qū)域，試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見(jiàn)表4。

 由表4可知，顯著因素濃度在試驗(yàn)6的條件下，酶活力最高(2 630±122 U/g)，因此選擇試驗(yàn)6的條件作為響應(yīng)面設(shè)計(jì)因素水平的中心點(diǎn)，即麩皮（X2）、豆粕（X6）和水分（X9）分別為180，190和360 g。

2.4響應(yīng)面法優(yōu)化

  根據(jù)中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，設(shè)計(jì)三因素三水平共20個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)面分析試驗(yàn)，其中14個(gè)析因點(diǎn)，6個(gè)零點(diǎn)重復(fù)，用以估計(jì)試驗(yàn)誤差，以氨肽酶酶活力為響應(yīng)值，分析米曲霉Y-15固態(tài)發(fā)酵氨肽酶活力的最佳條件。響應(yīng)面設(shè)計(jì)的因素與水平取值見(jiàn)表5，試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見(jiàn)表6。

 以氨肽酶固態(tài)發(fā)酵的酶活力為響應(yīng)值，運(yùn)用Design-Expert軟件進(jìn)行回歸擬合，得到回歸方程：

  對(duì)此模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表7。從表7可以看出，在a=0.01水平時(shí)，模型回歸極顯著( p=0.000 1)，該模型R2=0.989 2，R2Adj=0.978 5，失擬項(xiàng)不顯著( p=0.064 1)，可見(jiàn)該方程對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行了很好的擬合。根據(jù)模型方程做響應(yīng)面（圖1），通過(guò)該組動(dòng)態(tài)圖可評(píng)價(jià)諸因素之間對(duì)成曲中蛋白酶活力的交互作用，同時(shí)可確定各因素的最佳水平及組合，得到X1=-0.04、X2=0.16、X3=0.3，即麥麩為179.8g，豆粕為191.6 g，水為386 g。

按照得到的優(yōu)化結(jié)果將米曲霉接入固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，制曲培養(yǎng)3d，測(cè)定成曲中氨肽酶活力，3次平行試驗(yàn)分別為：2 863，2 901和2 872 U/g，平均酶活力為2 879.67 U/g，預(yù)測(cè)值Y=2 888.08接近，試驗(yàn)與預(yù)測(cè)值有較好的擬合性。

3結(jié)論

  試驗(yàn)考察了碳源、氮源、初始pH、多種金屬離子及水分對(duì)米曲霉（A．oryzae）Y-15固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)氨肽酶的影響。在單因素及Plackett-Burman試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用中心組合響應(yīng)面法對(duì)發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，并建立了酶活力與麥麩、豆粕及水的添加量之間的二次多項(xiàng)回歸模型，得出最優(yōu)發(fā)酵條件為麥麩179.8 g，豆粕為191.6 g，水的添加量為386 g，在此條件下，氨肽酶的酶活力達(dá)到2 879.6 7 U/g。并且主要培養(yǎng)基成分為麥麩和豆粕，均來(lái)源于農(nóng)業(yè)加工廢棄物，成本低廉，而氨肽酶的酶活力較高，為氨肽酶工業(yè)化生產(chǎn)的研究提供試驗(yàn)基礎(chǔ)。