細菌纖維素的制備及其對LBKP性能的影響
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馬英輝1 李利軍1 盧美歡1 王銀存2
（1．陜西省微生物研究所，陜西西安，710043;2．西北大學，陜西西安，710069）
摘要：探討了以秸稈水解液作為唯一碳源生產(chǎn)細菌纖維素的工藝參數(shù)，并考察了細菌纖維素濕膜對漂白硫酸鹽闊葉木漿( LBKP)紙張性能的影響。實驗結(jié)果表明，以秸稈水解液作為唯一碳源，采用動靜兩步法制備細菌纖維素的最大產(chǎn)量為4.27 g/L；細菌纖維素濕膜添加到LBKP中能夠明顯提高紙張抗張指數(shù)、撕裂指數(shù)、耐破指數(shù)、耐折度、透氣度等物理性能。
關(guān)鍵詞：細菌纖維素；秸稈水解液；LBKP;紙張性能
中圖分類號：TS722DOI：10.11980/j. issn. 0254-508X．2016. 06. 005
細菌纖維素(BC)是由細菌合成的一種高性能納米纖維素材料，作為一種新興的高分子材料，具有傳統(tǒng)纖維素所無法比擬的物理、化學性質(zhì)，直徑為植物纖維的1/100，其彈性模量高達1.5×1010Pa，與鋁相當。細菌纖維素因其具有高純度、高結(jié)晶度、高聚合度、高持水能力、較好的生物相容性和可降解性等優(yōu)點，廣泛應用于音響膜、人工血管、復合材料、無紡布等重要領(lǐng)域。細菌纖維素在造紙工業(yè)中也已表現(xiàn)出廣闊的應用前景，如在涂料、增稠劑、增強劑、膠黏劑、高強度紙張、防偽紙制品、高品質(zhì)薄型印刷紙、可循環(huán)使用的嬰兒尿布等方面的開發(fā)應用。但目前細菌纖維素的產(chǎn)量低，生產(chǎn)成本還較高，價格較貴，使得其應用局限于某些高附加值產(chǎn)品的制造過程中。
利用木質(zhì)纖維廢棄物水解液作為碳源生產(chǎn)細菌纖維素能夠顯著降低其成本，本課題將以秸稈水解液為碳源，研究制備細菌纖維素的工藝參數(shù)，降低細菌纖維素的制備成本，促進細菌纖維素在造紙工業(yè)中的應用。
1實驗
1.1菌株
Glucon,acetobacter HC-N，實驗室保存，從土壤中分離獲得，并經(jīng)過秸稈水解液誘導的菌株。
1.2實驗儀器設備
培養(yǎng)箱、恒溫搖床、722可見分光光度計、攪拌器、光學顯微鏡、耐折度儀（GT- 6014-A）、臥式抗張強度儀( L&W SE060)、耐破度儀(SE180)、透氣度儀( 4110- 4320-1)、撕裂度儀(SE009)、纖維疏解機( mode1500-1)、抄紙機(HK-CP01)、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀( N-1200BV-OSB2100)、掃描電鏡(6700F)。
1.3實驗原料
秸稈水解液：秸稈粉碎后經(jīng)過多聚磷酸與生 物酶處理，層析柱純化后，真空濃縮為糖濃度10%的液體。
活化培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。
誘導培養(yǎng)基：秸稈水解液，調(diào)整糖濃度為2%。
基礎發(fā)酵培養(yǎng)基：秸稈水解液糖含量2%，蛋白胨0.5%，酵母粉0.5%，磷酸氫二鈉0.27%，檸檬酸0.115%，硫酸鎂0.025%．121℃滅菌20 min后加無水乙醇2%。
1.4實驗方法
1.4.1 Gluconacetobacter HC-N菌株的活化與誘導
1.4.1.1 菌種活化
將Glucon,acetobacter HC-N接種于固體活化培養(yǎng)試管中，30℃活化16 h，待長出菌落后，接種于液體活化培養(yǎng)基中，180 r/min、30℃搖瓶培養(yǎng)24 h。
1.4.1.2秸稈水解液誘導
將活化好的液體種子按10% N15%的接種量接種于糖濃度為2%的秸稈水解液中，180 r/min搖瓶培養(yǎng)，每隔4h測定種子液吸光度(OD)值(600 nm)，直到OD值達到1.5以上時，取出待用。
1.4.2細菌纖維素制備工藝優(yōu)化
1.4.2.1培養(yǎng)方式研究
采用基礎發(fā)酵培養(yǎng)基分別進行150 r/min搖瓶培養(yǎng)7d、30℃靜置培養(yǎng)7d，先150 r/min搖瓶40 h培養(yǎng)再靜置5d的培養(yǎng)，并對其進行對比，以找到秸稈水解液為唯一碳源的最佳培養(yǎng)方式。
1.4.2.2培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件研究
利用design-expert軟件設計因素水平實驗，考查碳源濃度、氮源種類及配比、合成因子種類及濃度以及培養(yǎng)條件對菌株Gluconacetobacter HC-N發(fā)酵秸稈水解糖制備細菌纖維素產(chǎn)量的影響，從而獲得以秸稈水解液為唯一碳源的最佳細菌纖維素制備工藝。
1.4.3細菌纖維素產(chǎn)量計算方法
將發(fā)酵獲得的細菌纖維素膜進行酸洗、堿洗以除去菌體，用蒸餾水洗至中性，80℃干燥4h，稱重。
1.4.4細菌纖維素對LBKP性能的影響
將發(fā)酵獲得的細菌纖維素濕膜進行酸洗、堿洗以除去菌體，用蒸餾水沖洗至中性，然后采用疏解分散機進行分散，剪切轉(zhuǎn)速為3000 r/min，剪切60 min,剪切分散，細菌纖維素用量分別為0. 5%、1%、2%（對LBKP絕干量），然后進行打漿、抄造手抄片，按照相應國家標準測定手抄片的定量、厚度、松厚度、透氣度、耐折度、抗張指數(shù)、撕裂指數(shù)、耐破指數(shù)。
2結(jié)果與討論
2.1 菌株Gluconacetobacter HC-N在以秸稈水解液為唯一碳源誘導培養(yǎng)基中的生長情況
圖1為菌株在誘導培養(yǎng)基中的生長情況。從圖1可以看出，菌株在前20 h處于調(diào)整期，菌體濃度基本無明顯的增長，這是由于秸稈水解液中存在一定量的多酚類物質(zhì)，一定程度上抑制了菌體的過快生長，不利的生長環(huán)境延長了菌株的調(diào)整期；20 h后，菌體濃度開始呈對數(shù)上升，40 h時OD值已經(jīng)達到2.0左右，說明菌株對惡劣的環(huán)境已經(jīng)適應；40 h后由于培養(yǎng)液營養(yǎng)耗盡，菌體濃度處于較穩(wěn)定的狀態(tài)。從圖1中OD達到2.0所需的時間來看，由于唯一碳源和抑制因子的存在，使得菌株Glucon,acetobacter HC-Ⅳ的生長周期變長。
2.2培養(yǎng)方式研究
圖2為不同培養(yǎng)方式對細菌纖維素產(chǎn)量的影響。從圖2可見，在不同的培養(yǎng)方式下，細菌纖維素產(chǎn)量差別較大，搖瓶培養(yǎng)7d時的細菌纖維素產(chǎn)量最低；而先搖瓶40 h后再靜置培養(yǎng)5d時細菌纖維素產(chǎn)量最高，達到3.2 g/L，因為秸稈水解液中含有抑制菌體生長的成分，菌體需要消耗大量的氧氣來抵抗水解液中的不良成分，搖瓶40 h后，菌體達到一定濃度，
菌體進入了穩(wěn)定期開始合成細菌纖維素，此時再靜置培養(yǎng)5d有利于纖維素鏈的延伸和保持較高的楊氏模量，所以先搖瓶后靜置的培養(yǎng)方式下細菌纖維素的產(chǎn)量最高。
2.3細菌纖維素制備工藝的單因素實驗
2. 3.1秸稈水解液糖濃度對細菌纖維素產(chǎn)量的影響
圖3所示為秸稈水解液碳源濃度對細菌纖維素產(chǎn)量的影響。從圖3中可以看出，菌株Gluconacetobact-er HC-N以葡萄糖作為碳源時，隨著葡萄糖濃度的增加，細菌纖維素產(chǎn)量隨之上升，在葡萄糖濃度約3%時，細菌纖維素產(chǎn)量達到最大，后隨碳源濃度的增加，細菌纖維素的產(chǎn)量趨于穩(wěn)定；而以秸稈水解液作為碳源時，由于水解液中多酚類物質(zhì)的存在，所以細菌纖維素產(chǎn)量會隨著秸稈水解液糖濃度的增加先增大后減小，依據(jù)圖3的趨勢線，當秸稈水解液中糖濃度為2%左右時，細菌纖維素產(chǎn)量最大。
2.3.2 添加氮源種類及濃度對細菌纖維素產(chǎn)量的影響
以秸稈水解液為唯一碳源的情況下，實驗了5種速效氮源對細菌纖維素產(chǎn)量的影響，結(jié)果見圖4。圖4顯示，有機氮源更能促進細菌纖維素的合成，是因為有機氮源的營養(yǎng)更豐富，能夠更有利于菌株對不良環(huán)境的克服，酵母粉和蛋白胨對細菌纖維素的產(chǎn)量影響差別很小，但酵母粉在濃度為0. 6%時，細菌纖維素產(chǎn)量最先達到高值，所以綜合考慮，酵母粉的濃度為0. 6%。
2.3.3添加乙醇、瓊脂、殼聚糖對細菌纖維素產(chǎn)量的影響
高分子聚合物如殼聚糖、瓊脂、明膠可改變發(fā)酵液黏度，也可改變細菌合成纖維素時纖維絲的裝配，從而可影響細菌的代謝途徑，誘導或阻礙細菌纖維素的合成。而乙醇作為細菌纖維素的能源物質(zhì)，對傳統(tǒng)木醋桿菌生產(chǎn)細菌纖維素具有促進作用，但針對此菌株且在以秸稈水解液為唯一碳源的培養(yǎng)基中，乙醇的加入是否有促進作用還未知，所以，本實驗通過采用用量1 g/L的瓊脂、殼聚糖、明膠和體積分數(shù)2%的乙醇考察其對細菌纖維素合成的影響，結(jié)果見圖5。
從圖5可以看出，乙醇的添加能夠明顯促進細菌纖維素的合成，可能是因為菌株在生長過程中會形成乙醇中間體，而后才合成纖維素，乙醇的加入能夠提高乙醇中間體的濃度，促進菌體進入下游纖維素的合成階段；而高分子物質(zhì)瓊脂和明膠效果與對照樣差別不大，原因可能是秸稈水解液削弱了瓊脂與明膠的增強作用；殼聚糖由于具有抑制菌株生長的作用，所以加入后明顯不利于細菌纖維素的合成；而乙醇與高分子物質(zhì)的混合加入，并沒有顯著提高細菌纖維素的合成效率。
2.3.4培養(yǎng)溫度、初始pH值對細菌纖維素產(chǎn)量的影響
圖6和圖7分別顯示了培養(yǎng)溫度和pH值對細菌纖維素合成的影響。由圖6可知，當培養(yǎng)溫度為28℃時，細菌纖維素的產(chǎn)量達到最大，為3. 53 g/L，后隨著溫度的升高，細菌纖維素產(chǎn)量呈下降趨勢。由圖7可知，當初始pH值為5和7時，細菌纖維素的產(chǎn)量無明顯差別，應在下一步的實驗中繼續(xù)研究。
2.4細菌纖維素制備工藝的Box-Behnken實驗
根據(jù)單因素實驗的結(jié)果，利用Design-expert 8.0設計Box-Behnken實驗，實驗方案及實驗結(jié)果如表1和表2所示。
由表3可見，在95%的置信區(qū)間內(nèi)，用Design-ex-pert最小誤差原則去掉不顯著項，擬合成的方程為：y= -9.2+0.8A+2.2B+3.1C+0.12AC -0.27A2-0. 36B2-0. 31C2。
圖8為該模型的學生化殘差分布圖。由圖8可以看出，其殘差各點的分布幾乎在一條直線上，說明模型擬合效果較好。
根據(jù)數(shù)學模型中各影響因素系數(shù)的絕對值大小可以看出各影響因素對細菌纖維素產(chǎn)量影響的強度。系數(shù)絕對值越大，該因素對因變量的影響越大。由此可知，單因素對細菌纖維素產(chǎn)量影響的強弱順序為pH值(C)>乙醇濃度（B）>碳氮比(A)，碳氮比與pH值的交互作用(AC)對細菌纖維素的產(chǎn)量影響最大。模型的參數(shù)優(yōu)化與驗證結(jié)果見表4。
從表4可以看出，在碳氮比為3:1、乙醇用量為3%、初始pH值為6.0時，細菌纖維素的產(chǎn)量為4. 27 g/L，與模型的相對誤差僅為2.5%左右。說明Design-expert 8.0軟件所建立的細菌纖維素產(chǎn)量與碳氮比、乙醇濃度、pH值關(guān)系模型準確、可靠。
綜上可知，以秸稈水解液為唯一碳源的細菌纖維素的最佳制備條件為：秸稈水解糖含量2%、酵母粉0.7%、磷酸氫二鈉0. 27%、檸檬酸0.115%、硫酸鎂0. 025%，初始pH值為6.0，滅菌后接種前加入用量3%的無水乙醇，30℃、150 r/min搖瓶培養(yǎng)40 h，然后28℃靜置5d，至液體培養(yǎng)基被消耗殆盡為止。此條件下獲得的細菌纖維素的產(chǎn)量為4. 27 g/L。
2.5細菌纖維素對LBKP性能的影響
2. 5.1 細菌纖維素分散前的照片
圖9為細菌纖維素的顯微鏡及SEM照片。從圖9中可以看出，細菌纖維素細長，長徑比遠高于普通化學漿纖維，因此，細菌纖維素極難分散成單根纖維，而是多根纖維的聚集體。如果分散不徹底，那么纖維素分子鏈上的游離羥基就無法很好地暴露出來，造成與植物纖維的結(jié)合不好，其手抄片的強度就會受到影響，不僅無法提高紙張性能，反而會因為其顆粒較大阻礙植物纖維間的結(jié)合，嚴重影響手抄片的強度。
2.5.2紙張性能測試
表5為添加不同用量細菌纖維素對LBKP性能的影響。從表5中明顯看出，添加一定量的細菌纖維素后，LBKP紙張的透氣度、耐折度、撕裂指數(shù)和耐破指數(shù)都有所增加，而紙張的松厚度、抗張指數(shù)變化不太明顯，主要原因是紙漿不同所致，即細菌纖維素對不同紙漿性能的增強效果不同，同時也與細菌纖維素的分散工藝有關(guān)，分散不完全會影響抄紙的各項指標，但從總體來說，細菌纖維素的適量加入有利于改善紙張性能。
3結(jié)論
3.1 以秸稈水解液作為唯一碳源，采用動靜結(jié)合兩步法合成養(yǎng)細菌纖維素的最佳條件為：秸稈水解糖含量2%、酵母粉含量0.7%、磷酸氫二鈉0.27%、檸檬酸0.115%、硫酸鎂0.025%，初始pH值為6.0，滅菌后接種前加入3%的無水乙醇，30℃、150 r/min搖瓶培養(yǎng)40 h，然后28℃靜置5d，獲得細菌纖維素產(chǎn)量為4.27g/L。
3.2細菌纖維素濕膜添加到漂白硫酸鹽闊葉木漿( LBKP)中能夠改善紙張的物理性能，但由于細菌纖維素性狀的特殊性，細菌纖維素的分散工藝與不同紙漿的結(jié)合能力還需進一步研究。
