Bio log ECO分析活性污泥微生物功能多樣性特征
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李明智1，2，張宇1，2，梅榮武1，2，韋彥斐1，2，王慧榮1，2，陳潛3，樓繼鋒3，厲林聰3
（1．浙江省環(huán)境保護科學(xué)設(shè)計研究院工程技術(shù)研究中心，浙江杭州310007；2．浙江環(huán)科環(huán)境研究院有限公司，浙江杭州310007；3．杭州余杭水務(wù)有限公司，浙江杭州311100）
摘要：利用Bio log ECO技術(shù)對余杭污水處理廠污泥原位減量示范工程的活性污泥微生物多樣性進行分析。結(jié)果表明：實驗組利用全部（6類）碳源能力得到增強，群落的豐富度、均勻度和多樣性具有顯著提高；實驗組對酚酸類、胺類碳源的利用度遠高于對照組；其中對a-D-乳糖、L-苯基丙氨酸、a-環(huán)式糊精.4-羥基苯甲酸、苯乙胺等5種碳源的利用能力顯著提高。綜合分析表明，菌劑強化后可使活性污泥微生物群落得到優(yōu)化，使得生化系統(tǒng)對碳源利用的深度和廣度均有較大提高。
關(guān)鍵詞：活性污泥；原位減量；Biolog ECO技術(shù)；微生物多樣性
中圖分類號：X172doi:10.3969/j.issn．1003-6504.2016.06.010 文章編號：1003-6504(2016)06-0055-04
Bio log方法是根據(jù)微生物對碳源底物的利用能力的差異，來描述群落中微生物的動態(tài)變化。其原理是微生物在利用碳源過程中產(chǎn)生的自由電子，與四唑鹽染料發(fā)生還原顯色反應(yīng)，顏色的深淺可以反映微生物對碳源的利用程度。該方法由美國的BIOLOG公司于1989年開發(fā)成功，最初應(yīng)用于純種微生物鑒定。1991年，Garland等開始將這種方法應(yīng)用于土壤微生
物群落的研究。
Bio log法借助于96孔微孔板，如革蘭氏陽性板(GP)、革蘭氏陰性板(GN)和生態(tài)板(ECO)等來實現(xiàn)。ECO板有6大類31種碳源，ECO板相對于GN板利用了更多生態(tài)有關(guān)的化合物，更適合于土壤微生物群落功能多樣性研究。ECO微孔板技術(shù)可以解析微生物群落生理特征的變化，為描述微生物群落功能多樣性提供了一種簡單、快速的方法，在土壤微生物群落H
較、污染物對環(huán)境微生物群落的影響評價、環(huán)境修復(fù)效果的評價等方面得到廣泛應(yīng)用。
廢水生化處理系統(tǒng)中的菌膠團（活性污泥）微生物含量豐富，其功能多樣性適宜用ECO板分析。我們課題組在前期研究中通過不同污水處理廠生化系統(tǒng)微生物菌群的解析，定向篩選可分泌大量胞外酶的功能性菌群強化污泥分解作用；同時通過實踐反復(fù)篩選獲得可控性較理想的微型后生動物用于污泥的強化捕食，優(yōu)化改善活性污泥生物相，最終形成了基于多生
境菌劑(multi-environmental microbial agent, MEMA)結(jié)合微型后生動物強化捕食的污泥原位減量技術(shù)，在現(xiàn)場中試獲得良好效果的基礎(chǔ)上在余杭污水處理廠的工程示范中獲得40%以上的污泥減量效果，且出水水質(zhì)得到改善，生化系統(tǒng)污泥性狀得到優(yōu)化。
本文采用Bio log技術(shù)對工程示范過程中活性污泥的微生物群落特征進行分析，比較實驗組與對照組污泥微生物碳源利用特點，旨在為污泥原位減量技術(shù)的優(yōu)化實施提供科學(xué)依據(jù)和理論指導(dǎo)。
1材料與方法
1.1實驗材料
供試樣品來源于余杭污水處理廠污泥原位減量工程示范研究中的實驗組和對照組活性污泥，分別在調(diào)試運行第7天、30天和90天時間采取污泥樣品，保存于本實驗室4℃冰箱。
1.2實驗儀器
Bio log Gen III Micro Stationr TM自動微生物鑒定系統(tǒng)、三洋MLR-352恒溫培養(yǎng)箱。
1.3 Bio log實驗
用移液槍取1 m L活性污泥到1.5 m L離心管中。在10 000 r/min下離心20 min，棄去上清液，加1 m L生理鹽水，在振蕩器上振動5 min使之混勻；再于10 000r/min下離心20 min，重復(fù)2次，除去其中的碳源；棄去上清液，加1 m L生理鹽水，在振蕩器上振動5 min使之混勻，于2 000 r/min下離心1 min。取上清液倒入裝有20 m L已滅菌生理鹽水(Na Cl，0.85% W/V)的試管中，并使其OD590維持在0.13+0.02。將上述稀釋液加入Bio log ECO微平板中(100 m L／孔)，然后在22℃下培養(yǎng)，每隔12 h用Bio l og細(xì)菌自動讀數(shù)儀讀取750 nm和590 nm下數(shù)據(jù)，連續(xù)測定5d。
1.4計算方法
孔的平均顏色變化率(A WCD，average well colordevelopment)計算。
式中：C為每個碳源孔的2波段光密度差值；R為對照孔的光密度值；n為底物數(shù)量（GN板n=95,ECO板n=31）。
微生物代謝活性用590 nm下的值減去750 nm下的值表示，并且<0.06和>-0.06的值修正為0。
統(tǒng)計分析應(yīng)用SPSS (Version10.0 for Windows)軟件，繪圖應(yīng)用Origin 8軟件。
2結(jié)果與討論
2.1 2種活性污泥對全部碳源的動力學(xué)特征分析
平均顏色變化率是反映微生物代謝活性，即利用單一碳源能力的重要指標(biāo)。實驗分別取余杭污水處理廠實驗組和對照組活性污泥進行ECO分析，結(jié)果見圖1。計算31種碳源的A WCD可見，隨著培養(yǎng)時間的延長，微生物利用碳源量呈逐漸增加的趨勢。2次取樣實驗分析均表明實驗組利用碳源總量在整個培養(yǎng)過程都顯著高于對照組，說明通過添加功能菌劑能使生化系統(tǒng)微生物的生理活性得到較大提高。圖1(a)、(b)對比可以看出實驗組在經(jīng)過3個月的運行后其污泥活性會比開始階段略有減弱，但依然顯著高于對照組。這說明功能菌劑的強化作用能夠維持較長一段時間，通過后期適當(dāng)?shù)奶硌a功能菌劑，可以保持生化系統(tǒng)一個較高的污泥活性，雖然系統(tǒng)排泥量減少很多，但不會影響污泥活性，從而保證出水水質(zhì)的穩(wěn)定。
2.2 2種活性污泥對不同種類碳源的動力學(xué)特征分析
按化學(xué)基團的性質(zhì)可以將ECO板上的31種碳源分成6類（見表1），即碳水化合物類、氨基酸類、羧酸類、酚酸類、胺類和多聚類。不同微生物對不同種類碳源的利用度會有差別。實驗分別統(tǒng)計每類碳源的AWCD情況(樣品為運行1個月活性污泥)（見圖2）。結(jié)果表明，實驗組經(jīng)過生物強化作用后與對照比在不同類型碳源利用上表現(xiàn)出差異性。功能菌劑的強化作用提高了實驗組對碳水化合物類、氨基酸類、酚酸類、胺類4類碳源的利用度，特別是對酚酸類、胺類2類碳源的利用度要遠高于對照(見圖2(e)和(f）。而對多聚類、羧酸類2類碳源的利用度均比較高，兩組之間沒有差異(見圖2(c)和(d），這說明這2類碳源比較容易被環(huán)境微生物所利用。
2.3 2種活性污泥生物多樣性指數(shù)分析
ECO板反應(yīng)孔的顏色變化數(shù)目在一定程度上可以間接反映土壤微生物群落結(jié)構(gòu)組成上的差異，顏色變化孔數(shù)越多表明微生物群落種類相對越豐富。通常把顏色變化孔數(shù)作為微生物功能多樣性的豐富度(S)。由表2可知，經(jīng)過生物強化作用的實驗組平均96 h顯色孔數(shù)分別達到26目和25目，而對照為21目，實驗組微生物群落豐富度提高21.0%。Shannon指數(shù)(H)是研究群落物種及個體數(shù)和分布程度的綜合指標(biāo)，是應(yīng)用最為廣泛的群落多樣性指標(biāo)之一。由表2可知，經(jīng)過生物強化作用實驗組Shannon指數(shù)平均為1.29，對照組為1.15，Shannon指數(shù)提高10.8%。均勻度指標(biāo)(evenness，E)反映微生物利用所有碳源基質(zhì)的平均活性水平。由表2可知，經(jīng)過生物強化作用實驗組E值要比對照組提高10.3%。研究表明，實驗組在經(jīng)過功能性微生物菌劑強化后，其群落豐富度、多樣性以及均勻度均比對照組有顯著提高。
2.4 活性污泥微生物群落功能多樣性主成分分析
以上分析結(jié)果表明，經(jīng)過生物強化的實驗組微生物群落對碳源利用能力得到顯著提高，為了進一步明確微生物群落對各種碳源的利用情況，本節(jié)將培養(yǎng)96 h的ECO數(shù)據(jù)進行標(biāo)準(zhǔn)化轉(zhuǎn)換后進行主成分分析( principal component analysis，PCA)，通過主成分分析可以將不同樣本的多元向量變換為互不相關(guān)的主元向量（PC1和PC2是主元向量的分量），在降維后的主元向量空間中可以用點的位置直觀地反映出不同微生物群落的代謝特征，結(jié)果見圖3，經(jīng)過不同時間生物強化處理后，在31中碳源構(gòu)建的主成分體系中存在明顯的空間分布差異，其中經(jīng)生物強化處理1周的活性污泥與對照差別不大，經(jīng)處理1個月和3個月的活性污泥與對照具有顯著差異。經(jīng)過PC1軸上最影響碳源利用的載荷值相關(guān)分析，D-半乳糖酸-y-內(nèi)酯、D-纖維二糖、a-D-乳糖、a-D-葡萄糖-1-磷酸、D-木糖、D-甘露醇、L-苯基丙氨酸、L-精氨酸、L-絲氨酸、甘氨酸-L-谷氨酸、y-羥丁酸、衣泰酸、a-丁酮酸、a-環(huán)式糊精、2-羥基苯甲酸、4-羥基苯甲酸、苯乙胺等17種碳源與PC1成正相關(guān)，說明經(jīng)過生物強化處理后活性污泥增強了對這些碳源的利用，特別對a-D-乳糖、L-苯基丙氨酸、a-環(huán)式糊精、4-羥基苯甲酸、苯乙胺等5種碳源的利用能力得到較大提高。而對D-半乳糖醛酸、丙酮酸甲酯、吐溫80、腐胺等4種碳源的利用能力略有減弱。主成分分析表明，生化系統(tǒng)經(jīng)過污泥減量功能菌劑的生物強化之后，活性污泥對碳源的利用率有了較大提高，說明其微生物群落發(fā)生了變化從而影響其功能的差異。
3結(jié)論
前期研究明確利用多生境菌劑結(jié)合微型后生動物強化捕食的污泥原位減量技術(shù)可在不影響出水水質(zhì)情況下獲得較好的污泥原位減量效果，實驗組污泥沉降性能和脫氫酶活力得到提高，這些說明活性污泥生物相得到優(yōu)化。本文對余杭污水處理廠污泥原位減量示范工程的活性污泥微生物多樣性進行分析，得出如下結(jié)論：
(l)Bio log ECO結(jié)果表明實驗組利用全部碳源的能力顯著高于對照組，并且在運行3個月后其污泥活性僅比開始階段略有減弱，說明多生境菌劑的強化作用使得生化系統(tǒng)保持一個較高的污泥活性，從而保證出水水質(zhì)穩(wěn)定。
(2)不同種類碳源的動力學(xué)特征分析表明多生境菌劑的強化作用提高實驗組對碳水化合物類、氨基酸類、酚酸類、胺類4類碳源的利用度，特別是對酚酸類、胺類2類碳源的利用度要顯著高于對照。同時，實驗組的群落豐富度、均勻度以及多樣性均有顯著提高。
(3)主成分統(tǒng)計分析表明，實驗組強化了對D-半乳糖酸- Y-內(nèi)酯等17種碳源的利用能力，其中對僅-D-乳糖、L-苯基丙氨酸、a-環(huán)式糊精、4-羥基苯甲酸、苯乙胺等5種碳源的利用能力得到極顯著提高。生化系統(tǒng)經(jīng)過菌劑強化后對碳源利用的深度和廣度均有了較大提高，說明其微生物群落得到了優(yōu)化從而表現(xiàn)出功能的差異。
