關(guān)于鎳和砷對(duì)銅綠微囊藻光合效應(yīng)影響的探索
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作者：鄭曉敏
提示: 本研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)銅綠微囊藻受到Ni2+協(xié)迫時(shí)，葉綠素a含量顯著下降，其他研究結(jié)果也表明Ni2+能抑制銅綠微囊藻和集胞藻的光合色素合成；As3+加人后葉綠素a含量明顯低于對(duì)照，但在低濃度范圍內(nèi)有一定的升高，隨后高濃度又開始下降，Mascher等對(duì)紅三葉草的研究也發(fā)現(xiàn)．低濃度砷處理時(shí)，植物的光合色素含量均有所提高．說明銅綠微囊藻和植物對(duì)低濃度的砷有一定的耐受佳，隨著砷濃度的增加，毒害作用趨于明顯。
研究表明，水體中的Ni2+對(duì)M. aerugonisa的生長有抑制作用，降低葉綠素a和藻藍(lán)蛋白的含量，破壞電子傳遞鏈，導(dǎo)致ROS的產(chǎn)生。而砷通過磷轉(zhuǎn)運(yùn)途徑進(jìn)入細(xì)胞污染物能夠引起反常的皮膚、腸胃、神經(jīng)問題，甚至能夠致癌。但Ni和As等重金屬污染物具有生物富集和積累的性質(zhì)，研究快速其快速檢測方法，對(duì)于了解其對(duì)細(xì)胞的傷害，有重要指示作用。
作為水體生態(tài)系統(tǒng)的初級(jí)生產(chǎn)者，銅綠微囊藻是一種常見的水華藻類，對(duì)污染物的脅迫反應(yīng)敏感，可以很好地反映水體污染的程度。關(guān)于重金屬對(duì)銅綠微囊藻脅迫的研究在國內(nèi)外已有大量的文獻(xiàn)報(bào)道，但對(duì)于葉綠素?zé)晒饧夹g(shù)的應(yīng)用較少。目前，葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力法具有快速、靈敏、對(duì)細(xì)胞無損傷且便于操作攜帶等優(yōu)點(diǎn)而得到了廣泛的使用。葉綠素光誘導(dǎo)熒光作為光合作用的探針，與PSⅡ反應(yīng)中心及反應(yīng)中心電子供體側(cè)和受體側(cè)氧化還原狀態(tài)密切相關(guān)，能提供大量光合系統(tǒng)功能的信息。因此，本文利用快速葉綠素?zé)晒鈩?dòng)態(tài)分析技術(shù)，探討鎳和砷的脅迫下，銅綠微囊藻的光合作用色素含量和葉綠素光誘導(dǎo)熒光動(dòng)力學(xué)特征的變化，同時(shí)分析鎳和砷作用在銅綠微囊藻電子傳遞鏈位點(diǎn)，對(duì)于分析不同重金屬污染的特性，并應(yīng)用于污染物的環(huán)境監(jiān)測中，有重要意義。
1材料與方法
1.1實(shí)驗(yàn)材料
銅綠微囊藻（M. aeruginosa）藻種來源于中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)淡水藻類藻種庫( FACHB)，無菌操作將藻種轉(zhuǎn)接至新鮮滅菌過的BG-11培養(yǎng)基內(nèi)，于光照培養(yǎng)箱中恒溫(20±1)℃，光強(qiáng)50 μE/(m2·s)，24 h持續(xù)光照培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期。
1.2實(shí)驗(yàn)方法
1.2.1鎳和砷對(duì)銅綠微囊藻的處理方法
將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的銅綠微囊藻無菌操作轉(zhuǎn)移至滅菌過的250 mL錐形瓶中，然后加入NiS04·6H2O，使Ni2+的終濃度為0、0.1、0.2、0.5、0.8、1 mg/L，藻液密度為8.lxlOs個(gè)/mL，分別在0，24，48，72，96 h，測定銅綠微囊藻的葉綠素a含量和熒光參數(shù)。
將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的銅綠微囊藻無菌操作轉(zhuǎn)移至滅菌過的250 mL錐形瓶中，然后加入As302，使As3+的終濃度為0、0.5、l、2、3、5 mg/L，藻液密度為8.lx105個(gè)/mL，分別在0，24、48、72、96 h，測定銅綠微囊藻的葉綠素a含量和熒光參數(shù)。
1.2.2葉綠素a的測定
葉綠素濃度的測定參照李合生等的方法。取5 mL處理后的藻液，8 000 r/min離心10 min后棄上清，收集藻體，加入等體積的95%乙醇，置4℃冰箱放置24 h，中間搖晃2—3次，離心(8 000 r/min，10 min)，用UV-2000型分光光度計(jì)在665 nm和649 nm波長下測定離
心后上清液的光密度值D666和D649，用公式C=13.7×D666 - 5.76×D649計(jì)算葉綠素a濃度，單位為μg/mL。
1.2.3熒光參數(shù)測定
取經(jīng)不同濃度Ni2+和As3+處理后的銅綠微囊藻培養(yǎng)物2 mL，暗適應(yīng)15 mm，采用葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力學(xué)參數(shù)采用便攜式植物效率分析儀(PEA，HanasatechR．U．K)于室溫下測定，激發(fā)光強(qiáng)為最大光強(qiáng)的50%(約1 500 μE/(m2·s))，記錄時(shí)間為5s。葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)動(dòng)力學(xué)曲線反應(yīng)了電子傳遞鏈參數(shù)的變化，除O-J-I-P的變化情況外，還可得到大量關(guān)于電子傳遞情況的原始數(shù)據(jù)，處理后可獲得關(guān)于PSII反應(yīng)中心原初光化學(xué)反應(yīng)的各種信息，各參數(shù)具體含義見表1。
1.2.4數(shù)據(jù)分析
本文所有數(shù)據(jù)是多次平行實(shí)驗(yàn)結(jié)果，取平均值，用origin作圖，并用One-Way ANOVE進(jìn)行顯著性分析。
2結(jié)果與分析
2.1 不同濃度鎳和砷對(duì)銅綠微囊藻葉綠素a含量的影響
如圖l所示，在加入Ni2+后，隨處理時(shí)間的延長及Ni2+濃度升高，葉綠素a含量顯著降低(p<0.05)；在處理l d時(shí)各處理組的葉綠素a含量均顯著低于對(duì)照組，在加入Ni2+后4 d，0.1 mg/L Ni2+處理組的葉綠素a含量比同期對(duì)照組降低56.5%，l mg/L Ni2+處理組降低了97.2%。在加入As3+后，隨處理時(shí)間的延長及濃度升高，葉綠素a含量仍然升高(p<0.05)，各處理組葉綠素a含量低于對(duì)照組，但各處理組除2 d時(shí)差異顯著外．其他并不顯著，如在加入As3+后4d時(shí)，0.5、l，5mg/L處理組的葉綠素a含量比同期對(duì)照組降低36.3%、22.4%、29.0%。結(jié)果表明Ni2+比As3+的作用效果明顯。
2.2 不同濃度鎳和砷對(duì)銅綠微囊藻光合活性(Fv/Fm)影響
如圖2所示，在加入Ni2+后，隨處理時(shí)間的延長及Ni2+濃度升高，F(xiàn)V/Fm顯著降低；在處理l d時(shí)各處理組的Fv/Fm即顯著低于對(duì)照組，在加入Ni2+后4d，F(xiàn)v/Fm值極顯著降低(p<0.01)。在加入As3+后，隨處理時(shí)間的延長及濃度升高,Fv/Fm仍然升高，但各處理組Fv/Fm低于對(duì)照組，各處理組除2d時(shí)差異顯著外，其他處理
時(shí)間并不顯著(p>0.05)。結(jié)果表明Ni2+比As3+對(duì)光合活性的作用效果要明顯。
2.3不同濃度鎳和砷對(duì)銅綠微囊藻葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力曲線的影響
由圖3可以看出，在經(jīng)過Ni2+和As.3+處理后，銅綠微囊藻的葉綠素?zé)晒鈴?qiáng)度和誘導(dǎo)曲線的不同相均發(fā)生了變化。在加入Ni2+第1天時(shí)銅綠微囊藻的熒光強(qiáng)度均顯著(p<0.05)降低，低濃度(<0.8 mg/L)處理組誘導(dǎo)曲線的J點(diǎn)和P點(diǎn)均顯著下降但并未消失，高濃度處理組的J點(diǎn)和P點(diǎn)基本消失，在經(jīng)過Ni2+處理4d時(shí)熒光強(qiáng)度顯著降低，J相和P相均已基本消失，表明電子傳遞鏈?zhǔn)軗p嚴(yán)重。在加入As3+后ld時(shí)銅綠微囊藻的熒光強(qiáng)度均降低，各處理組的J相和P相均變?nèi)�，在加入As3+后4d時(shí)低濃度處理組的熒光強(qiáng)度低于對(duì)照組，J相和P相都得到一定恢復(fù)，表明As3+導(dǎo)致電子傳遞鏈?zhǔn)茏璧⑽粗袛唷?
2.4不同濃度鎳和砷對(duì)銅綠微囊藻光合電子傳遞鏈參數(shù)的影響
快速葉綠素誘導(dǎo)動(dòng)力學(xué)曲線的光化學(xué)性能參數(shù)中包含的3個(gè)參數(shù)pDo、RC/CSo和ETo/ABS反映了植物光合機(jī)構(gòu)的狀態(tài)和脅迫對(duì)光合機(jī)構(gòu)的影響。在加入外源不同濃度Ni2+和As3+離子處理后，發(fā)現(xiàn)銅綠微囊藻的PSII反應(yīng)中心受體側(cè)電子傳遞鏈?zhǔn)茏�，反�?yīng)中心活性降低，熱耗散增加（表2）。在處理4d后，Ni2+處理組銅綠微囊藻各光合參數(shù)繼續(xù)降低，但As3+處理的RC/CSo則升高，表明單位面積內(nèi)反應(yīng)中心的數(shù)量增加，說明在適應(yīng)As3+處理一段時(shí)間后，銅綠微囊藻的適應(yīng)能力增強(qiáng)。
3討論
在藻類和高等植物中，光合電子傳遞由2個(gè)光反應(yīng)（PS I和PSⅡ）中心串聯(lián)進(jìn)行，在光合膜上PS I和PSⅡ通過包括質(zhì)體醌(PQ)、Cyt b6/f復(fù)合體和質(zhì)藍(lán)素(PC)在內(nèi)的一系列電子傳遞體連結(jié)在一起，電子傳遞過程中在光合膜兩側(cè)建立的質(zhì)子梯度可以驅(qū)動(dòng)ATP的合成。葉綠素?zé)晒夥从沉酥参锕夂舷到y(tǒng)功能的變化狀況，如熒光參數(shù)值Fv/Fm的變化表明了PSⅡ原初光能轉(zhuǎn)換效率能力的大小，pDo表示用于熱耗散的量子比率，RC/CSo表示單位面積內(nèi)反應(yīng)中心的數(shù)量，ETo /ABS表示用于電子傳遞的量子產(chǎn)額等。
在不同的環(huán)境條件下，O-J-I-P多相瞬態(tài)會(huì)改變形狀并提供大量的光合系統(tǒng)功能狀況的信息。因此，OJIP測定已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于不同脅迫下各種光合放氧生物的研究。本文的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Ni2+脅迫下銅綠微囊藻PSⅡ活性（Fv/Fm)呈現(xiàn)顯著下降趨勢，OJIP曲線形狀發(fā)生改變，當(dāng)Ni2+濃度達(dá)到0.8mg/L時(shí)，J相和P相已基本消失，pDo、RC/CSo以及ETo/ABS的變化（表2）均表明反應(yīng)中心受體側(cè)電子傳遞鏈?zhǔn)艿綋p傷，反應(yīng)中心活性下降。Huang等的研究也表明，Ni2+脅迫銅綠微囊藻會(huì)導(dǎo)致ROS的增加，而大量的ROS會(huì)破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)并引起DNA的損傷，從而影響光合系統(tǒng)的功能。As3+脅迫銅綠微囊藻時(shí)，低濃度處理組的PSⅡ活性有所上升，高濃度下降，與葉綠素a含量的變化趨勢基本一致，表現(xiàn)了銅綠微囊藻對(duì)低濃度As3+迫的耐受性。有大量的文獻(xiàn)報(bào)道，藍(lán)藻中存在類金屬硫蛋白使得藻細(xì)胞對(duì)低濃度的重金屬有一定的抗性，而砷可以誘導(dǎo)金屬硫蛋白的產(chǎn)生。因此本研究中銅綠微囊藻對(duì)低濃度的砷有一定的耐受性可能是因?yàn)樵寮?xì)胞被砷誘導(dǎo)出類金屬硫蛋白，從而使其對(duì)低濃度的砷表現(xiàn)出一定的抗性。As和P都是第V主族元素，因此As034-在結(jié)構(gòu)上與P034-艮相似，可以通過磷轉(zhuǎn)運(yùn)途徑進(jìn)入細(xì)胞�；铙w條件下氧化磷酸化和光合磷酸化的共同點(diǎn)是ATP合成均與電子傳遞偶聯(lián)，也就意味著若缺乏ATP的合成，電子傳遞就會(huì)受到限制，因此在As3+脅迫下銅綠微囊藻的光合活性降低可能是由于As3+進(jìn)入磷轉(zhuǎn)運(yùn)而導(dǎo)致ATP合成受到破壞，從而使電子傳遞鏈?zhǔn)艿綋p傷。
