如何測定鹽藻中脫鎂葉綠素含量?
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作者：張磊
葉綠素極不穩(wěn)定，在光照、氧、酸和溫度的條件下，極易被破壞。葉綠素在稀堿液中可皂化水解成鮮綠色的葉綠酸（鹽）、葉綠醇和甲醇。在酸溶液中可成暗綠至綠褐色的脫鎂葉綠素[10]。杜氏鹽藻主要含有葉綠素a，由于其對光、熱和酸敏感，性質(zhì)極不穩(wěn)定。在遇酸的時候，中心金屬鎂被氫置換脫離成暗綠色至暗褐色的脫鎂葉綠素，加熱可以促使脫鎂反應(yīng)的進(jìn)行；而葉綠素在稀堿中水解后生成的葉綠酸仍呈綠色并易溶于水，比較穩(wěn)定，但是脫鎂以后變?yōu)槊撴V葉綠素，色澤呈暗褐色[11-13]。研究發(fā)現(xiàn)，脫鎂葉綠素對小鼠具有光過敏毒性，是引起日光性皮炎的光敏性物質(zhì)[14]。由于鹽藻中含有B一胡蘿卜素和葉綠素等色素，當(dāng)前科學(xué)界普遍使用的測定方法是先用85%丙酮將藻粉中的基本色素萃取出來，在通過無水硫酸鈉除去丙酮和水，然后將色素轉(zhuǎn)移到無水乙醚中，再用鹽酸將脫鎂葉綠素提取出來，通過分光光度法來確定其含量[15-16]。這一方法，在具體的分析測定過程中，存在很多不穩(wěn)定的因素[17]，比如光照以及細(xì)胞破碎的程度或者鹽酸的用量等。因此，考察了在鹽藻中測定脫鎂葉綠素的過程中，細(xì)胞的破碎方法、丙酮及鹽度積分?jǐn)?shù)等對脫 鎂葉綠素測定的影響，研究了影響脫鎂葉綠素含量測 定的主要因素以及最優(yōu)條件。
1 材料和方法
1.1藻種的培養(yǎng)
藻種由內(nèi)蒙古吉蘭泰生物工程公司提供，培養(yǎng)方 法見文獻(xiàn)[5]。培養(yǎng)到可采收濃度待用，采收計數(shù)及方 法詳見研究報導(dǎo)[18-19]。
1.2藥品
鹽酸：北京市朝陽區(qū)化工四廠；丙酮：天津市永大化學(xué)試劑開發(fā)中心；無水硫酸鈉：天津市化學(xué)試劑三廠；無水乙醚：天津市永大化學(xué)試劑開發(fā)中心。所用藥品均是分析純。
1.3試驗(yàn)方法
1.3.1細(xì)胞的破碎
細(xì)胞破碎的方法很多，可以分為物理法（機(jī)械法）和化學(xué)法兩類。常用的物理方法有研磨法、搗碎法、高壓法、超聲波法和反復(fù)凍融法等；化學(xué)法有滲透、干燥、自溶、酶處理、表面活性處理等方法[20]。無論是機(jī)械破碎法還是非機(jī)械法破碎細(xì)胞都有自身的局限性和不足，應(yīng)根據(jù)破碎細(xì)胞的目的、回收目標(biāo)產(chǎn)物的類型和它在細(xì)胞中所處的位置，選用合適的方法，達(dá)到選擇性的分步釋放目標(biāo)產(chǎn)物的要求[20]。不同類型的細(xì)胞需要使用不同的細(xì)胞破碎方法，杜氏鹽藻無細(xì)胞壁，其形狀隨著滲透壓變化在發(fā)生變化。由于上述特點(diǎn)，在提取葉綠素和脫鎂葉綠素的時候，選擇了超聲波破碎法和反復(fù)凍融法。反復(fù)凍融法是將細(xì)胞在低溫下冷凍，然后在室溫下融化，反復(fù)多次使細(xì)胞破碎。超聲波破碎法是根據(jù)大量的聲能轉(zhuǎn)化為彈性波形式的機(jī)械能，引起細(xì)胞液局部的剪切梯度致使細(xì)胞破碎。
1.3.2脫鎂葉綠素的測定
將鹽藻細(xì)胞破碎以后，用配制好的85%丙酮溶液提取色素，重復(fù)三次，定容，將其轉(zhuǎn)入無水乙醚中，并重復(fù)加入5%的無水硫酸鈉反復(fù)洗去丙酮和水；然后加入固體硫酸鈉除去無水乙醚中少量的水，再將其轉(zhuǎn)入17%的鹽酸當(dāng)中，最后再經(jīng)過飽和硫酸鈉脫去鹽酸進(jìn)入到無水乙醚層中，定容后。使用分光光度計測定在一定波長下的吸光度。試驗(yàn)中嘗試了不同配比的丙酮、精餾乙醚、不同濃度的無水硫酸鈉和不同體積分?jǐn)?shù)的鹽酸對測試結(jié)果的影響。
2結(jié)果和分析
2.1 凍融法破碎藻細(xì)胞
多次試驗(yàn)證明，反復(fù)凍融法破碎藻細(xì)胞是不可行的。試驗(yàn)把培養(yǎng)好的鹽藻經(jīng)過冰箱里反復(fù)凍融四次，發(fā)現(xiàn)藻細(xì)胞形態(tài)良好，沒有絲毫異常。藻細(xì)胞如圖1所示。藻細(xì)胞可以在0C—38 0C的溫度內(nèi)生存[7]，甚至有人觀察到在零下的環(huán)境中也能生存，故反復(fù)凍融法對于鹽藻細(xì)胞的破碎是難以實(shí)現(xiàn)的。
2.2超聲波破碎法
超聲波破碎法對與藻細(xì)胞是十分有效的。在超聲波功率達(dá)到300 W時候，只要1 min藻細(xì)胞已經(jīng)完全破裂。破碎后的鹽藻細(xì)胞如圖2所示。試驗(yàn)證明，超聲波破碎鹽藻細(xì)胞是完全可行的。
2.3丙酮濃度
試驗(yàn)對脫鎂葉綠素的測定方法作了如下幾步的探索。先從丙酮人手，試驗(yàn)嘗試了50%，60%，70%,80%和90%的配比，但是其結(jié)果沒有太大的變化，也很難看出丙酮的濃度與脫鎂葉綠素含量的相關(guān)性。丙酮濃度對脫鎂葉綠素測定結(jié)果的影響見表1。
2.4精餾乙醚
無水乙醚經(jīng)過精餾之后，用于提取色素。以未蒸餾的無水乙醚為對照。試驗(yàn)結(jié)果見表2。試驗(yàn)表明使用精餾乙醚對脫鎂葉綠素含量沒有明顯的改變。
2.5無水硫酸鈉的濃度和洗滌次數(shù)
試驗(yàn)使用了多組不同濃度的和不同次數(shù)的無水硫酸鈉洗滌，脫鎂葉綠素含量與未改變條件之前相比均沒有太大的變化。
2.6鹽酸體積分?jǐn)?shù)
常規(guī)的檢測方法中，鹽酸的加入量為17%。在多次試驗(yàn)過程中，發(fā)現(xiàn)鹽酸的配比牽涉到了從無水乙醚中萃取色素量的大小，鹽酸層的顏色可以間接的反應(yīng)出了脫鎂葉綠素含量的高低。因此嘗試加大鹽酸量。試驗(yàn)選取了不同鹽酸的配比，對其標(biāo)樣進(jìn)行了平行試驗(yàn)，測定的脫鎂葉綠素含量見表3。由表3中可以看出，當(dāng)鹽酸配比達(dá)到了26%的時候，所得到的脫鎂葉綠素的含量與標(biāo)樣的有關(guān)數(shù)值一致。
由試驗(yàn)數(shù)據(jù)可以得出，鹽酸體積分?jǐn)?shù)在26%左右時，所測得的脫鎂葉綠素含量數(shù)值與標(biāo)樣測定的結(jié)果相接近。試驗(yàn)繼續(xù)在25.00%—25.80%之間測定樣品的脫鎂葉綠素的含量，每組鹽酸體積分?jǐn)?shù)相同的樣品，平行取三個樣，得出平均值如表4。并且又重新測定了其他標(biāo)準(zhǔn)樣品，數(shù)值與實(shí)際結(jié)果基本接近。由此可以得出，當(dāng)鹽酸體積分?jǐn)?shù)為25.80%時，測定值最接近標(biāo)樣的實(shí)際值。
3結(jié)論
試驗(yàn)通過對脫鎂葉綠素測定方法的探索，得出了鹽酸體積分?jǐn)?shù)是影響其測定效果的主要因素。試驗(yàn)初步確定了鹽酸體積分?jǐn)?shù)是25.80%時，測定的脫鎂葉綠素的含量較接近標(biāo)樣的實(shí)際數(shù)值。改進(jìn)后的脫鎂葉綠素的檢測方法可用于食品行業(yè)中脫鎂葉綠素含量測定的參考。
4摘要
考察了鹽藻中測定脫鎂葉綠素含量的過程中，細(xì)胞的破碎方法、丙酮及鹽酸體積分?jǐn)?shù)等對脫鎂葉綠素含量的影響，得出了鹽酸體積分?jǐn)?shù)對脫鎂葉綠素含量的測定影響最大的結(jié)論并且確定了鹽酸配比是25.80%時，測定的脫鎂葉綠素的含量較接近標(biāo)樣的實(shí)際數(shù)值。
