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    作者：曹健國(guó)

    類肝素是指天然的、合成的和半合成的與肝素有類似作用的物質(zhì)。類肝素能夠與數(shù)百種蛋白質(zhì)相結(jié)合，從而影響蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象、壽命和生物活性；類肝素還可以和胞外基質(zhì)中的多種蛋白質(zhì)相結(jié)合，控制他們的分布、轉(zhuǎn)移和信息傳遞。因此，類肝素是一種重要的信息分子，能夠?qū)χ黧w細(xì)胞的行為如細(xì)胞的增殖、分化、結(jié)合起調(diào)控作用，并參與外來(lái)細(xì)胞的識(shí)別和控制過(guò)程。舒洛地特、冠心舒等類肝素藥物因安全有效性得到患者的認(rèn)同。

    肝素是從豬小腸黏膜中提取的黏多糖物質(zhì)，具有顯著地抗凝血和防止血栓形成的作用，在臨床中常作為抗凝血藥物。在利用樹脂吸附法提取肝素鈉的傳統(tǒng)工藝中，由于大量的蛋白被樹脂吸附，在樹脂洗脫條件單一的情況下，造成大量類肝素殘留在廢蛋白中，其中主要包括硫酸軟骨素、硫酸皮膚素、硫酸乙酰肝素和少量殘留肝素，從而導(dǎo)致資源浪費(fèi)。筆者提出了一種從廢蛋白中提取類肝素的工藝，并確定了其最佳的工藝條件。

1材料與方法

1.1  材料與儀器

    肝素鈉標(biāo)準(zhǔn)品，357 U/mL，U．S．PharmacopeialConvention生產(chǎn)；綿羊血漿，山東蒼山向明生化助劑廠生產(chǎn)；FPA98 Cl樹脂：Rohm and Haas Company生產(chǎn)；2709酶，北京東華強(qiáng)盛生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)；雙氧水，無(wú)錫市晶科化工有限公司；乙醇等其他試劑，均為分析純，市售。

    雙層玻璃反應(yīng)釜：S212B型，杭州惠創(chuàng)儀器設(shè)備有限公司生產(chǎn)；磁力攪拌油浴鍋：DF -Ⅱ型，常州澳華儀器有限公司生產(chǎn)；紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：752N型，上海儀電分析儀器有限公司生產(chǎn)；手持式pH計(jì)：PHB_4型，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司生產(chǎn)；真空干燥箱：DZF -6021型，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司生產(chǎn)。

1.2  實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1  類肝素提取工藝

類肝素提取工藝流程如圖1所示。

    首先采用2709堿性蛋白酶進(jìn)行酶解，酶解時(shí)蛋白與水體積比約為1：2，加入2709酶的酶量為1g/L，反應(yīng)溫度設(shè)置為53℃，pH為8.5左右，鹽濃度為0.6 mol/L左右，保溫時(shí)間為3h。保溫結(jié)束后升溫至80℃，滅酶活反應(yīng)15 min。吸附階段首先加入0.5 g/L的FPA98 Cl樹脂進(jìn)行吸附，吸附條件為58℃，鹽濃度為0.8 mol/L左右，pH為8左右，吸附時(shí)間為8—10 h。吸附結(jié)束后，收集樹脂，第1次洗脫依次用55℃pH 9的堿液洗滌20 min，55℃鹽濃度為0. 82 mol/L的鹽水洗滌20 min，55℃鹽濃度為4.5 mol/L的鹽水洗脫4h，洗脫結(jié)束后收集洗脫液，靜置冷卻，再將樹脂放在55℃鹽濃度為4.5  mol/L的鹽水進(jìn)行第2次洗脫，洗脫2h。洗脫結(jié)束后收集一二次洗脫液混合進(jìn)行醇沉，加入90%酒精進(jìn)行沉淀，沉淀24 h后，將上清液倒去，將沉淀加入水溶解，然后進(jìn)行氧化步驟。氧化步驟首先將pH調(diào)至11.5左右，加入雙氧水氧化，初加入時(shí)pH會(huì)降低，需進(jìn)行補(bǔ)堿操作，氧化時(shí)間為6h左右，氧化完成后用亞硫酸氫鈉中和多余的雙氧水，然后將pH調(diào)至1.8左右，加入鹽酸進(jìn)行酸沉，酸沉之后離心取上清液。將pH調(diào)至5左右，電導(dǎo)率調(diào)至50 mS左右，然后進(jìn)行醇沉，電導(dǎo)率在10 mS左右，醇沉之后進(jìn)行脫水干燥，最終得到類肝素產(chǎn)品。

1.2.2  類肝素效價(jià)的測(cè)定方法

    采用冷凍羊血漿法測(cè)定類肝素效價(jià)。稱取類肝素原料或量取類肝素注射液適量，按估計(jì)效價(jià)用0.15 mol/L的NaCl溶液稀釋至標(biāo)準(zhǔn)溶液(8 U/mL)相當(dāng)?shù)男�價(jià)濃度，根據(jù)綿羊血漿的半凝固點(diǎn)分別吸取樣品和標(biāo)準(zhǔn)品的3到5個(gè)梯度，加1 mL綿羊血漿和0. 02 mol/L的CaCl2溶液0.8 mL，置于(37±0.5)℃水浴t h，記錄每管凝結(jié)程度，類肝素效價(jià)計(jì)算式為：

    x=(VS×V×Cs)／（V×Wm)    (1)

    得到類肝素的總單位為：

Ut5=Xxm    (2)

式中，X為類肝素效價(jià)，U/mg；Vs為標(biāo)準(zhǔn)品1/2凝固度的肝素加入體積，uL；Cs為標(biāo)準(zhǔn)品溶液的濃度，U/mL；Vm為樣品1/2凝固度時(shí)的樣液加人體積，uL；W為樣品稱取的質(zhì)量，mg；V為測(cè)定樣品的總體積，mL；m為類肝素的質(zhì)量，mg。

1.3單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

    在吸附工藝中，單因素包括吸附溫度、pH、鹽濃度。將現(xiàn)有車間工藝作為平衡工藝，使其中1個(gè)工藝參數(shù)進(jìn)行改變，其他參數(shù)保持不變，從而得到一個(gè)合理的參數(shù)范圍。

1.4  類肝素提取工藝的優(yōu)化

    依照單因素試驗(yàn)結(jié)果，利用正交軟件design -Expert設(shè)計(jì)各個(gè)步驟的單因素進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)。

2結(jié)果與分析

2.1  廢蛋白酶解實(shí)驗(yàn)

在肝素生產(chǎn)工藝中有酶解工藝，為了驗(yàn)證提取類肝素工藝中是否還需進(jìn)行酶解實(shí)驗(yàn)，將相同批次的等量蛋白進(jìn)行對(duì)比實(shí)驗(yàn)，第1組進(jìn)行酶解反應(yīng)，加入2709酶的酶量為1g/L，溫度為53℃，pH為8.5左右，鹽濃度為0.6 mol/L左右，保溫時(shí)間為3h。保溫結(jié)束后升溫至80℃，滅酶活反應(yīng)15 min，編號(hào)為1。第2組不進(jìn)行酶解反應(yīng)，將該組吸附條件調(diào)至與第1組一致，其他步驟反應(yīng)條件也保持一致，編號(hào)為2。得到的對(duì)比實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示。

    由表1可以看出，酶解與否對(duì)于最后得率、吸光度、旋光度都沒(méi)有顯著的影響，考慮到工業(yè)生產(chǎn)成本，對(duì)廢蛋白的酶解步驟可以省略掉。

2.2廢蛋白吸附實(shí)驗(yàn)

2.2.1  吸附溫度對(duì)類肝素得率的影響

吸附條件設(shè)定在pH為8，鹽濃度為0.8 mol/L，吸附時(shí)間為8h，考察吸附溫度對(duì)類肝素得率的影響，結(jié)果如圖2所示。由圖2可見(jiàn)，當(dāng)溫度為59℃時(shí)，類肝素的得率最高。溫度過(guò)低會(huì)影響樹脂的吸附能力，溫度過(guò)高會(huì)破壞類肝素的穩(wěn)定性，影響得率。

2.2.2  吸附pH對(duì)類肝素得率的影響

吸附條件設(shè)定在溫度為59℃，鹽濃度為0.8 mol/L，吸附時(shí)間為8h，考察吸附pH對(duì)類肝素得率的影響，結(jié)果如圖3所示。由圖3可以看出，pH為8.5時(shí)，類肝素得率最高。

2.2.3  吸附鹽濃度對(duì)類肝素得率的影響

吸附條件設(shè)定在溫度為59℃，pH為8.5，吸附時(shí)間為8h，考察吸附鹽濃度對(duì)類肝素得率的影響，結(jié)果如圖4所示。由圖4可以看出，鹽濃度為0.7 mol/L時(shí)，類肝素得率最高。

2.2.4正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化吸附工藝結(jié)果

依據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，利用design -Expert軟件對(duì)廢蛋白吸附工藝的溫度、鹽濃度、pH進(jìn)行因素Box -Benhnken設(shè)計(jì)。產(chǎn)生17個(gè)試驗(yàn)，試驗(yàn)因素水平如表2所示，結(jié)果如表3所示。

從表3中可看出，選用的廢蛋白中提取類肝素總單位數(shù)回歸模型具有高度的顯著性(P<0.0001)。失擬項(xiàng)在a=0.05水平上不顯著(P=0.0501>0. 05)，其校正決定系數(shù)為0.9930，表明此模型可解釋99. 300/0響應(yīng)值的變化，僅有0.70%的總變異不能由此模型進(jìn)行解釋。復(fù)相關(guān)系數(shù)為0. 983 9，說(shuō)明該模型擬合程度良好，試驗(yàn)誤差小。同時(shí)從F值和P值可以看出，溫度對(duì)提取效果的影響顯著(P<0. 01)。

2.2.5正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化工藝參數(shù)的試驗(yàn)驗(yàn)證

利用構(gòu)建的類肝素總單位數(shù)回歸模型進(jìn)行模擬得到不同的最優(yōu)工藝路線，不同工藝路線模擬值與真實(shí)值比較結(jié)果如表4所示。

    從表4可以看出，在優(yōu)化條件下，類肝素總單位數(shù)的預(yù)測(cè)值與實(shí)際值具有很好的相關(guān)性，可利用上述模型對(duì)實(shí)際吸附過(guò)程進(jìn)行預(yù)測(cè)和控制。類肝素吸附工藝經(jīng)過(guò)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)后，最佳工藝參數(shù)最后確定為：溫度為55cC，鹽濃度為0.8 mol/L，pH為8.72。

2.3粗品類肝素的氧化提純

    廢蛋白經(jīng)過(guò)吸附后，再經(jīng)過(guò)脫附、醇沉步驟后，可以得到類肝素粗品，但由于雜質(zhì)很多，效價(jià)很低，旋光度、吸光度都達(dá)不到質(zhì)量要求，因而需要進(jìn)行氧化提純。

2.3.1  雙氧水的量對(duì)類肝素得率的影響

將類肝素粗品按照質(zhì)量比為1：15用水進(jìn)行溶解，pH調(diào)至11.5，均分為6份，加入不同量的雙氧水進(jìn)行氧化，分別是體積比1：100、2：100、3：100、4：100、5：100、6：100，對(duì)應(yīng)為6組。氧化時(shí)間為6h，氧化結(jié)束后將pH調(diào)至7，加入亞硫酸氫鈉除去多余的雙氧水，之后將pH調(diào)至1.8，進(jìn)行酸沉，離心除去固體，取上清液，進(jìn)行醇沉。醇沉終點(diǎn)控制在電導(dǎo)率為10 mS左右，醇沉?xí)r間為12 h，結(jié)束后將固體烘干，得到類肝素產(chǎn)品。結(jié)果如圖5所示。

    從圖5可以看出，雙氧水濃度過(guò)低、過(guò)高都會(huì)導(dǎo)致類肝素得率下降。這是因?yàn)檫^(guò)低時(shí)，雜質(zhì)沒(méi)有完全氧化，影響到效價(jià)；而過(guò)高時(shí)，雙氧水會(huì)破壞類肝素分子。當(dāng)雙氧水體積比為2：100時(shí)，類肝素得率最高。

2.3.2氧化時(shí)間對(duì)類肝素得率的影響

實(shí)驗(yàn)條件同2.3.1中一樣，當(dāng)雙氧水體積比為2：100時(shí)，氧化時(shí)間(2、4、6、10、15、24 h)對(duì)類肝素得率的影響如圖6所示。

    從圖6可以看出，氧化時(shí)間為6h時(shí)，類肝素得率最高。類肝素得率不會(huì)隨著氧化時(shí)間的增加而提升，這是因?yàn)轭惛嗡卮嬖诘男问绞桥c其他物質(zhì)結(jié)合在一起，時(shí)間越久，解離率越高，有效成分被氧化的越多，得率越低。

    因此，在提取類肝素的工藝中，最佳氧化條件為加入雙氧水量的體積比為2：100，氧化時(shí)間為6h。

3結(jié)論

提出了從肝素提取過(guò)程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物廢蛋白里提取類肝素的工藝，通過(guò)單因素試驗(yàn)與正交試驗(yàn)優(yōu)化確定了吸附工藝的最佳條件：溫度為55℃，鹽濃度為0.8 mol/L，pH為8.72。氧化工藝最佳條件為：加入雙氧水的量的體積比為2：100，氧化時(shí)間為6h。該工藝使廢蛋白變?yōu)轭惛嗡�，�?duì)現(xiàn)有的肝素企業(yè)也有很好的參考價(jià)值。

4摘要：

提出了一種從肝素提取過(guò)程中產(chǎn)生的廢蛋白中提取類肝素的工藝。以類肝素總單位數(shù)為評(píng)價(jià)指標(biāo)，通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)確定了吸附工藝最佳條件：溫度為55℃，鹽濃度為0 8 mol/L，pH為8.72。氧化工藝最佳條件為：加入雙氧水的量與待氧化的類肝素粗品溶液體積比為2：100，氧化時(shí)間為6h。與傳統(tǒng)的處理廢蛋白的方式相比，有效地增加了其經(jīng)濟(jì)價(jià)值。