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作者：曹健國(guó)

    多糖是由糖苷鍵結(jié)合而成的糖鏈，是一類不溶于水、無(wú)甜味、不能形成結(jié)晶，無(wú)還原性和變旋現(xiàn)象的高分子碳水化合物，在臨床上作用有很多，如調(diào)節(jié)免疫功能、抗癌、降血糖等。目前常用的多糖檢測(cè)方法主要為將樣品進(jìn)行水提醇沉后，采用堿性酒石酸銅滴定法、比色法（苯酚一硫酸法、蒽酮一硫酸法）進(jìn)行檢測(cè)。若樣品中存在淀粉，糊精類物質(zhì)，因其在醇沉?xí)r也可以沉淀，會(huì)干擾樣品多糖的檢測(cè)結(jié)果，所以在做多糖分析時(shí)需要將其去除。常見(jiàn)的方法有AOACRoberts銅法、酶解法等。AOAC Roberts銅法主要通過(guò)堿性二價(jià)銅試劑選擇性地沉淀具有葡聚糖結(jié)構(gòu)的多糖而去除其他雜質(zhì)的干擾作用，此法的缺點(diǎn)是需反復(fù)洗滌、多次過(guò)濾，操作步驟過(guò)多，使得測(cè)定結(jié)果誤差較大。酶解法則是酶直接作用于淀粉、糊精，將其水解成葡萄糖，之后用乙醇沉淀分離粗多糖，進(jìn)行檢測(cè)。但在實(shí)際操作中需注意不同來(lái)源、不同廠家酶活力的差異，需進(jìn)行試驗(yàn)以確定酶的用量。保健食品功效成分檢測(cè)重點(diǎn)參考的《保健食品功效成分檢測(cè)方法》中這兩種方法可用于排除淀粉、糊精等對(duì)多糖檢測(cè)的干擾，但未有二者效果對(duì)比的數(shù)據(jù)，且目前仍鮮見(jiàn)類似的文獻(xiàn)報(bào)道。

    靈芝是我國(guó)傳統(tǒng)中藥材，其中含有的活性多糖具有提高機(jī)體免疫力、抗腫瘤、抗氧化、抗衰老、清除自由基、降血糖等功效。靈芝咖啡為靈芝提取物與咖啡的合理配伍，對(duì)工作壓力大、免疫力低下、易疲勞人士具有良好的保健作用。因該產(chǎn)品中除了含有上述活性多糖外，還含有部分淀粉、糊精類非活性多糖成分，在粗多糖檢測(cè)分析時(shí)容易造成干擾。而《藥典》2010版及其第二增補(bǔ)本“靈芝”項(xiàng)中關(guān)于靈芝多糖的檢測(cè)也僅限于單味靈芝藥材中多糖的檢測(cè)，對(duì)其復(fù)方及含有淀粉等輔料的深加工產(chǎn)品中多糖的檢測(cè)并未提及。因此試驗(yàn)分別對(duì)AOAC Roberts銅法、酶解法去除淀粉、糊精的干擾效果進(jìn)行了對(duì)比，旨在篩選適用于靈芝咖啡中粗多糖定量分析的方法，并從中選出最佳方法進(jìn)行工藝優(yōu)化，為靈芝咖啡的質(zhì)量控制及其他含有淀粉、糊精的產(chǎn)品中多糖的檢測(cè)提供科學(xué)依據(jù)。

1  材料與方法

1.1材料與儀器

1.1.1材料與試劑

    靈芝咖啡：福建仙芝樓生物科技有限公司；葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品：美國(guó)Sigma-Aldrich公司；液狀a-淀粉酶：成都艾科達(dá)化學(xué)試劑有限公司；氫氧化鈉、硫酸銅、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、檸檬酸鈉、無(wú)水硫酸鈉、蒽酮、硫酸、乙醇等試劑均為分析純。

    硫酸一蒽酮溶液：精密稱取蒽酮0.1 g，加80%的硫酸溶液100 mL使溶解，搖勻。

    0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 6.5)：31.5 mL( 0.2 mo/L)磷酸氫二鈉與68.5 mL( 0.2 mol/L)磷酸二氫鈉混合。

    10%氫氧化鈉溶液：稱取100 g氫氧化鈉，加水溶解至1L，加入固體無(wú)水硫酸鈉至飽和，備用。

    銅試劑儲(chǔ)備液：稱取3.0 g五水硫酸銅，30.0 g檸檬酸鈉，加水溶解至1L，混勻備用。

    銅試劑溶液：取銅試劑儲(chǔ)備液50 mL，加蒸餾水50 mL，混勻后加入固體無(wú)水硫酸鈉12.5 g，溶解，現(xiàn)用現(xiàn)配。

    洗滌劑：取蒸餾水50 mL，加入50 mL銅試劑溶液，50 mL氫氧化鈉溶液，混勻。

1.1.2儀器與設(shè)備

    UV-2450紫外一可見(jiàn)分光光度計(jì)：日本島津公司；KQ-100E型超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；AR1140型萬(wàn)分之一電子分析天平：美國(guó)奧豪斯儀器有限公司；DK-S28電熱恒溫水浴鍋：上海精科實(shí)業(yè)有限公司；Anke TDL-40B臺(tái)式離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.2方法

1.2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

    精密吸取葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.20 mg．mL-1）0，0.2，0.4，0.6，0.8和1.0 mL，分別置于25 mL比色管中，準(zhǔn)確補(bǔ)水至2.0 mL，加入6.0 mL蒽酮硫酸溶液，在旋轉(zhuǎn)混勻器上混勻，沸水浴中煮沸15 min，冷卻后用分光光度計(jì)于625 nm處檢測(cè)吸光度。以吸光度(Y)為縱坐標(biāo)，葡聚糖質(zhì)量(X)為橫坐標(biāo)，計(jì)算得回歸方程。

1.2.2靈芝咖啡中粗多糖測(cè)定方法比較

1.2.2.1  常規(guī)水提醇沉法

    精密稱取靈芝咖啡樣品2.0 g，置于100 mL容量瓶中，加入80 mL蒸餾水使其溶解，沸水浴中2h，定容，過(guò)濾，取5 mL加人無(wú)水乙醇20 mL，4℃冰箱中沉淀過(guò)夜，離心10 min，棄去上清液，沉淀用5 mL 80%乙醇溶液洗滌，離心后棄去上清液，沉淀定容至合適體積，吸取2 mL按1.2.1中方法進(jìn)行顯色并檢測(cè)吸光度。

1.2.2.2酶解法

    精密稱取靈芝咖啡樣品2.0 g，置于100 mL容量瓶中，加水80 mL，于沸水中加熱15 min使其完全溶解，同時(shí)做空白對(duì)照（容量瓶中不加樣品，其他操作同上）。將樣品與空白樣冷卻至60℃以下，加入1.0 mLα-淀粉酶溶液和0.5 mL 0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液，60℃水中酶解60 min后取出（用碘液檢驗(yàn)是否酶解完全，如不完全，延長(zhǎng)時(shí)間至酶解完全），至沸水浴中滅酶30 min，冷卻，定容，過(guò)濾。取5 mL濾液加入20 mL無(wú)水乙醇沉淀粗多糖(4℃，12 h)。離心后將沉淀用80%乙醇洗滌后離心棄去上清液，沉淀加水定容至合適體積，吸取2 mL置于25 mL比色管中，加入6.0 mL蒽酮硫酸溶液，參照1.2.1中方法進(jìn)行顯色并檢測(cè)吸光度。

1.2.2.3  AOAC Roberts銅法

    精密稱取靈芝咖啡樣品2.0 g，置于100 mL容量瓶中，加入80 mL蒸餾水使其溶解，100℃水浴中2h，定容，過(guò)濾，取5 mL加入無(wú)水乙醇20 mL沉淀粗多糖(4℃．12 h)，離心10 min，棄去上清液，沉淀用5 mL 80%乙醇溶液洗滌，離心后棄去上清液，加入5mL lo%氫氧化鈉溶液，5 mL銅試劑，100 0C 10 min，冷卻后離心，沉淀用洗滌劑洗滌2遍，加入1 mL lo%硫酸溶液，定容至25 mL，吸取2 mL按1.2.1中方法進(jìn)行顯色并檢測(cè)吸光度。

1.2.3酶解法測(cè)定靈芝咖啡中粗多糖酶解條件優(yōu)化

    以粗多糖含量測(cè)得值為指標(biāo)，根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取酶解時(shí)間、加酶量、酶解溫度為考察因素，采用L9(34)進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)酶解條件進(jìn)行優(yōu)化。

1.2.4酶解法測(cè)定靈芝咖啡中粗多糖方法學(xué)試驗(yàn)

    測(cè)定低限：平行測(cè)20次空白值并參照GB/T27404-2008中方法進(jìn)行方法測(cè)定低限的計(jì)算。

    精密度：精密稱取6份2.0 g靈芝咖啡樣品，采用酶解法進(jìn)行粗多糖含量測(cè)定，考察方法的精密度。

  穩(wěn)定性：將精密度試驗(yàn)中醇沉后的粗多糖溶液樣品分別在0，2，4，6，8和10 h時(shí)進(jìn)行顯色測(cè)定吸光度，考察溶液穩(wěn)定性。

    回收率：在已知粗多糖含量的靈芝咖啡粗多糖溶液中加入一定量的標(biāo)準(zhǔn)品，分別取測(cè)定低限濃度及2個(gè)合適濃度水平，每個(gè)水平測(cè)定3次，進(jìn)行回收率試驗(yàn)。

2結(jié)果與分析

2.1靈芝咖啡中粗多糖測(cè)定方法比較結(jié)果

常規(guī)水提醇沉法、酶解法與AOAC Roberts銅法檢測(cè)靈芝咖啡中粗多糖結(jié)果如表1。由表中常規(guī)水提醇沉法數(shù)據(jù)可知淀粉、糊精對(duì)樣品中粗多糖含量測(cè)定結(jié)果影響較大。酶解法與AOAC Roberts銅法均可排除淀粉、糊精對(duì)樣品中粗多糖含量測(cè)定的影響。但AOACRoberts銅法測(cè)得結(jié)果低于理論值，’且偏差較大，因該法需反復(fù)洗滌，多次離心，操作步驟過(guò)多，容易產(chǎn)生損耗，導(dǎo)致結(jié)果偏低。相比之下，酶解法測(cè)得值較接近理論值．因此采用酶解法進(jìn)行靈芝咖啡中粗多糖的檢測(cè)較合適。

2.2酶解法測(cè)定靈芝咖啡中粗多糖酶解條件優(yōu)化

    酶解法測(cè)定靈芝咖啡中粗多糖酶解條件正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2，方差分析見(jiàn)表3。

由表2和表3可知，各個(gè)因素對(duì)靈芝咖啡中粗多糖測(cè)定結(jié)果的影響順序?yàn)槊附鈺r(shí)間>酶解溫度>加酶量。試驗(yàn)中靈芝咖啡粗多糖含量理論值為1.34%，因此最優(yōu)條件應(yīng)選擇最接近理論值的A382C2組合，即酶解時(shí)間為60 min，加酶量為1.0 mL，酶解溫度為75℃，且由表3中方差分析結(jié)果可知酶解時(shí)間、酶解溫度對(duì)靈芝咖啡中粗多糖測(cè)定結(jié)果影響顯著，加酶量影響不顯著。

2.3酶解法測(cè)定靈芝咖啡中粗多糖方法學(xué)試驗(yàn)

2.3.1測(cè)定低限

    方法的測(cè)定低限為0.001 21 mg/mL。

2.3.2精密度

    靈芝咖啡中粗多糖含量平均值為1.38%，RSD=2.06%，精密度良好。

2.3.3穩(wěn)定性

    靈芝咖啡粗多糖溶液樣品在10 h內(nèi)穩(wěn)定性良好，RSD=1.79%。

2.3.4回收率

回收率結(jié)果如表4所示。平均回收率為98.34%，RSD=2.48%。

3結(jié)論與討論

    α-淀粉酶，也稱α-1，4葡萄糖-4-葡萄糖水解酶，可隨機(jī)水解淀粉、糖原及降解物內(nèi)部的α-D-1，4糖苷鍵，使底物溶液黏度下降和碘反應(yīng)消失，產(chǎn)生可溶性糊精、低聚糖及少量麥芽糖、葡萄糖。目前較多地通過(guò)微生物發(fā)酵法制得，廣泛應(yīng)用于制糖業(yè)、釀造業(yè)、改性淀粉和紡織業(yè)高溫退漿等工藝中。將淀粉酶用于富含淀粉的原料中活性多糖提取也是常采用的方法。試驗(yàn)將α-淀粉酶用于含淀粉、糊精等物質(zhì)的產(chǎn)品中粗多糖的測(cè)定，取得了較理想的效果，與常規(guī)水提醇沉法及AOAC Roberts銅法相比，更接近產(chǎn)品中實(shí)際粗多糖的含量。正交試驗(yàn)得出最佳酶解條件為酶解時(shí)間為60 min、加酶量1.0 mL、酶解溫度75℃，其中酶解時(shí)間、酶解溫度對(duì)結(jié)果影響顯著。酶解反應(yīng)需要一定的反應(yīng)時(shí)間及適宜的溫度，當(dāng)?shù)孜锼�解完全后，延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間對(duì)結(jié)果無(wú)影響，溫度過(guò)高過(guò)低均會(huì)影響酶活力，導(dǎo)致底物水解不完全，致使檢測(cè)結(jié)果偏高。另外，酶的種類及保藏條件及時(shí)間也會(huì)影響酶的活力，因此反應(yīng)條件的選擇不能以一概全，需按具體情況進(jìn)行考察。

    在酶法降解淀粉過(guò)程中，文獻(xiàn)報(bào)道較多采用淀粉酶與糖化酶（如α-葡萄糖苷酶）進(jìn)行協(xié)同處理，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)將液態(tài)α-淀粉酶處理結(jié)束后的樣液再加入α-葡萄糖苷酶（約為樣液體積的1%）繼續(xù)處理，測(cè)得粗多糖值與直接用液態(tài)α-淀粉酶處理所測(cè)得粗多糖值相比無(wú)顯著差異，說(shuō)明采用液態(tài)α-淀粉酶處理后的水解產(chǎn)物不會(huì)干擾靈芝咖啡中粗多糖的檢測(cè)，因此，對(duì)文獻(xiàn)報(bào)道中的方法做了簡(jiǎn)易化修改，即不采用a-葡萄糖苷酶進(jìn)行處理。另外，在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，在酶解法進(jìn)行檢測(cè)時(shí)需加入空白對(duì)照，否則會(huì)使檢測(cè)結(jié)果略偏高。

試驗(yàn)結(jié)果表明：酶解法可以較好地消除樣品內(nèi)淀粉、糊精等的影響，方法穩(wěn)定、可靠，可作為靈芝咖啡中粗多糖的測(cè)定方法。

3摘要  

建立靈芝咖啡中粗多糖含量檢測(cè)方法并對(duì)其工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。通過(guò)對(duì)常規(guī)水提醇沉法、AOAC Roberts銅法及酶解法幾種方法進(jìn)行比較，確定酶解法適合靈芝咖啡中粗多糖含量的檢測(cè)。以靈芝咖啡中粗多糖含量為指標(biāo)，通過(guò)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)考察酶解時(shí)間、加酶量、酶解溫度等試驗(yàn)因素對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響。采用該法進(jìn)行檢測(cè)的最佳條件為：酶解時(shí)間為60 min，加酶量為1mL，酶解溫度為75℃。方法的精密度良好，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.06%，且待測(cè)樣品溶液在10 h內(nèi)穩(wěn)定，回收率為95.13%~103,33%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.48%。采用酶解法可以較好地消除樣品內(nèi)淀粉、糊精等對(duì)粗多糖檢測(cè)的干擾，方法穩(wěn)定、可靠，可作為靈芝咖啡及其他含有淀粉、糊精的產(chǎn)品中粗多糖的檢測(cè)方法。