利用牛血紅蛋白制備血紅素多肽的新工藝
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午血液營養(yǎng)豐富，血紅蛋占全血蛋白質(zhì)的80%;血紅蛋白由血紅素和珠蛋白結(jié)合而成，每1血紅蛋白分子由4分子珠蛋白和4分子亞鐵血紅素組成，珠蛋白約占96%，血紅素占4%。經(jīng)過現(xiàn)代生物酶解技術(shù)，血紅蛋白在被降解成多肽的同時，釋放出血紅素或血紅素肽。血紅素或血紅素肽則是一種優(yōu)良的補(bǔ)鐵劑。血紅素可制成補(bǔ)血營養(yǎng)劑用于治療缺鐵性貧血引起的各種疾病，與硫酸亞鐵補(bǔ)鐵劑相比，血紅素鐵的生物利用率高出23%，紅素多肽還可制成氨基酸口服液、注射液及復(fù)合液用于補(bǔ)充強(qiáng)化各種氨基酸。但由于血紅蛋白分子結(jié)構(gòu)致密，蛋白酶具有底物專一性，使酶解不夠徹底且酶解過程中會產(chǎn)生疏水性氨基酸含量較高的苦味小肽等問題，限制了血紅素多肽的推廣和應(yīng)用。因此，為獲得苦味值較低的富血紅素多肽產(chǎn)物，試驗(yàn)篩選了適于生產(chǎn)血紅素多肽的用酶，對血紅蛋白進(jìn)行分步酶解，最終得到最佳酶解方法和工藝條件。為血紅素多肽產(chǎn)品的開發(fā)與生產(chǎn)奠定一定的理論基礎(chǔ)。
1 材料與方法
1.1材料、儀器與設(shè)備
牛血紅蛋白粗制品，新鮮牛血抗凝處理，紗布過濾后，3 000 r/min離心15 min，棄去上清液，收集下層紅細(xì)胞，用生理鹽水洗滌2-3次，超聲波細(xì)胞破碎后冷凍干燥備用；木瓜蛋白酶（76 900 U/g蛋白質(zhì)）：上海瑞永生物科技有限公司；中性蛋白酶( 25 600 Ulg)和堿性蛋白酶（46 200 U/g蛋白質(zhì)）：北京房山酶制劑廠；風(fēng)味蛋白酶（22 400 U/g蛋白質(zhì)）：上海實(shí)驗(yàn)試劑有限公司；氯化血紅素對照品：天津福德士科技有限公司；喹琳：天津市化學(xué)試劑一廠；其他試劑均為分析純。
DK-8D數(shù)顯恒溫水浴鍋：金壇市富華儀器有限公司；Neofuge-15R臺式高速冷凍離心機(jī)：力康發(fā)展有限公司；凱氏定氮裝置：泉州市萬達(dá)實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備；BS2000S電子分析天平：丹佛儀器（北京）有限公司；FDU-1200冷凍干燥機(jī)：上海愛朗儀器有限公司；UVmini-1240紫外可見分光光度計：島津國際貿(mào)易（上海）有限公司；PHS-3C型pH計：上海精密儀器儀表有限公司。
1.2試驗(yàn)方法
1.2.1工藝流程
血紅蛋白粗制品一加酶攪拌（控制反應(yīng)條件）一沸水浴滅酶( 15 min)_離心(4 200xg，20 min)一酶解液一冷凍干燥一血紅蛋白多肽。
1.2.2酶活測定
福林酚法。
1.2.3氨基態(tài)氮測定
甲醛滴定法。
1.2.4血紅素測定
紫外分光光度法。
1.2.5苦味值評價
稱取哇琳0.1 9溶于50 mL 5%乙醇溶液中，取5 mL 該溶液用蒸餾水稀釋到100 mL，得到1.0×10。4 g/mL哇琳溶液，再進(jìn)一步稀釋成5×10-5，2.5×10。5，lxl0。6和5×10。7 g/mL質(zhì)量濃度的哇琳溶液，其苦味值分別定義為10，5，2.5，l和0.5分，選6位具有風(fēng)味評價經(jīng)驗(yàn)人員品嘗多肽溶液的苦味與不同濃度哇琳溶液比較，從而確定多肽溶液的苦味。
1.2.6水解度測定
水解度DH=酶解液中氨基態(tài)氮／酶解液中總氮含量x 100% (1)
1.2.7總氮測定
凱氏定氮法。
1.3正交試驗(yàn)設(shè)計
1.3.1單酶酶解
采用L，6(45)正交表‘61研究酶種類、底物濃度、酶濃度和水解時間4種因素對水解度、血紅素、苦味值等指標(biāo)的影響。試驗(yàn)因素水平表見表l。
1.3.2分步酶解
在 
正交試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇合適用酶，確定用酶濃度，在酶的最適水解溫度及pH下進(jìn)行分步酶解，并采用Lg(34)考察底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)、水解時間比例、酶添加量比例和pH對各指標(biāo)的影響，優(yōu)化最佳酶解參數(shù)。試驗(yàn)因素水平表見表2。
2.1單酶酶解各因素對指標(biāo)的影響結(jié)果分析
單酶酶解正交試驗(yàn)設(shè)計及結(jié)果參見表3。
2.1.1水解度分析
由表4方差分析結(jié)果顯示：酶種類和水解時間水解度指標(biāo)影響顯著，各因素影響程度大小依次為酶種類、水解時間、底物濃度和酶濃度。
由效應(yīng)曲線圖1可以看出，酶種類對水解度影響的優(yōu)劣順序?yàn)橹行缘鞍酌�、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶。底物濃度對水解度影響的優(yōu)劣順序?yàn)?%，4%，2%和60-/0；酶濃度對酶解液中水解度含量影響的優(yōu)劣順序?yàn)? 000，2 000，4 000和8 000 U/g;水解時間優(yōu)劣順序?yàn)?，9，5和3h。
因此對于水解度這一指標(biāo)來說最優(yōu)組合是：中性蛋白酶，底物濃度8%，酶濃度6 000 U/g，水解時間7h。
2.1.2血紅素含量分析
由表5方差分析結(jié)果顯示，酶的種類對水解液中血紅素含量的影響達(dá)到顯著水平，其它因素的影響不顯著，各因素影響程度的大小排列為酶種類、水解時間、酶濃度和底物濃度。
由效應(yīng)曲線圖2可以看出，酶種類對水解液中血紅素含量影響的優(yōu)劣順序?yàn)閴A性蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶；底物濃度對血紅素含量影響的優(yōu)劣順序?yàn)?0-/0，2%，8%和40-/0；酶濃度對酶解液中血紅素含量影響的優(yōu)劣順序4 000，8 000，2 000和6 000 U/g水解時間優(yōu)劣順序?yàn)?，5，9和7h。
因此對于血紅素這一指標(biāo)來說，最優(yōu)組合是：堿性蛋白酶，底物濃度60-，酶濃度4 000 U/g，水解時間3h。
2.1.3苦味值分析
由方差分析表6結(jié)果顯示：酶種類和水解時間對酶解液水解度影響顯著，各因素影響程度大小依次為酶種類、水解時間、底物濃度和酶濃度。
由效應(yīng)曲線圖3可以看出，酶種類對苦味值的影響優(yōu)劣順序?yàn)轱L(fēng)味蛋白酶、堿性蛋酶、中性蛋白酶和木瓜蛋白酶；底物濃度對苦味值的影響的優(yōu)劣順序?yàn)?%，4%，6%和8%;酶濃度對苦味值影響的優(yōu)劣順序?yàn)? 000，2 000，4 000和8 000 U/g。水解時間優(yōu)劣順序?yàn)?，3，7和9 h。
因此對于苦味值這一指標(biāo)來說最優(yōu)組合是：風(fēng)蛋白酶，底物濃度2 0-10，酶濃度6 000 U/g，水解時5h。
2.2分步酶解用酶的確定
以血紅素含量為指標(biāo)，堿性蛋白酶最好，這與萬根等的研究結(jié)果一致。原因可能是血紅素在堿條件溶解性更好，不易相互聚集沉淀，以水解度為標(biāo)，中性蛋白酶最好，這與瞿桂香等的研究結(jié)果致。中性蛋白酶是最佳酶，可能與它的專一性不強(qiáng)關(guān)，可以推測，從蛋白質(zhì)上水解下來的肽段可以繼：被中性蛋白酶水解，形成分子量較小的多肽和氨：酸。以苦味值為指標(biāo)，風(fēng)味蛋白酶最好。風(fēng)味蛋酶水解度不高，但苦味值較低，可能是因?yàn)轱L(fēng)味蛋酶為外切酶，作用于肽鏈末端的肽鍵，酶解產(chǎn)物主：為氨基酸和大分子肽，可減少水解液苦味。由于j驗(yàn)?zāi)康脑谟诳辔吨档偷母谎t素多肽，因此選用堿一蛋白酶與風(fēng)味蛋白酶作為分步酶解用酶。由酶濃度j血紅素和苦味值的影響優(yōu)劣順序，以及為底物提供，夠的酶解用酶，確定酶濃度為6 000 U/g。
2.3分步酶解各因素對指標(biāo)的影響結(jié)果分析
分步酶解正交試驗(yàn)設(shè)計及結(jié)果參見表7。
2.3.1水解度分析
由表8方差分析圖可以看出，各因素對水解度的影響均不顯著，這可能是因素之間有互作效應(yīng)，所以誤差平方和較大，從而使因素的效應(yīng)達(dá)不到顯著水平。相對來說優(yōu)劣順序?yàn)樗鈺r間、底物濃度、酶添加量比例和水解時間比例。
由效應(yīng)曲線圖4可以看出，水解時間對水解度影響優(yōu)劣順序?yàn)?0，8和6h，底物濃度對水解度影響的優(yōu)劣順序?yàn)?0-/0，8%和40-/0，酶添加量比例優(yōu)劣順序?yàn)?:5，7:3和9:1，水解時間比例對血紅素含量影響的優(yōu)劣順序?yàn)?：2，2:1和1:1。
因此對于水解度這一指標(biāo)來說最優(yōu)組合是：水解時間10 h，底物濃度6%，酶添加量比例5:5，水解時間比例1：2。
2.3.2血紅素含量分析
由方差分析表9可以看出，各因素對血紅素指標(biāo)無顯著影響�？赡苁且蛩刂g有互作效應(yīng)，所以誤差平方和較大，從而使因素的效應(yīng)達(dá)不到顯著水平。相對來說優(yōu)劣順序?yàn)椋好柑砑恿勘壤⑺鈺r間、底物濃度和水解時間比例。
由效應(yīng)曲線圖5可以看出，酶添加量比例優(yōu)劣順序?yàn)?:1，5：5和7:3，水解時間對酶解液血紅素含量影響優(yōu)劣順序?yàn)?0，6和8h，底物濃度對血紅素含量影響的優(yōu)劣順序?yàn)?%，40-/0和8%，水解時間比例對血紅素含量影響的優(yōu)劣順序?yàn)?：1，2:1和1:2。
因此對于血紅素這一指標(biāo)來說最優(yōu)組合是：水解時間10 h，底物濃度6%，酶添加量比例9:1，水解時間比例1：1。
2.3.3苦味值分析
由方差分析表10可以看出，底物濃度，酶添加量比例，水解時間對苦味值影響顯著，相對來說優(yōu)劣順序?yàn)榈孜餄舛�，水解時間，酶添加量比例，水解時間比例。
由效應(yīng)曲線圖6可以看出，水解時間對苦味值影響優(yōu)劣順序?yàn)?0，8和6h，底物濃度對水解度影響的優(yōu)劣順序?yàn)?0-/0，8%和40-/0，酶添加量比例優(yōu)劣順序?yàn)?:5，7:3和9:1，水解時間比例對苦味值影響的優(yōu)劣順序?yàn)?：1，2：1和1：2。
因此對于苦味值這一指標(biāo)來說最優(yōu)組合是：水解時間10 h，底物濃度6%，酶添加量比例5：5，水解時間比例1：1。
2.3.4單酶酶解與分步酶解各指標(biāo)對比
由圖7分析可知分步酶解的氨基氮含量，水解度，血紅素含量，明顯高于單酶酶解，而苦味值相對較低，可以判斷分步酶解效果明顯優(yōu)于單酶酶解效果。
3討論
底物濃度是分步酶解中最重要的因素，對水解度和苦味值指標(biāo)影響很大。通過各指標(biāo)分析可知底物濃度6%時最宜，原因可能是4%時底物濃度太低，沒有足夠的底物與酶形成中間復(fù)合物，而底物在8%時，由于濃度較大，血紅蛋白形成稠狀的物料，流動性差，不利酶的連續(xù)作用，因此其水解效果比底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%時較差。影響分步酶解的另一重要因素是時間，由各指標(biāo)綜合分析，10 h酶解效果最佳，可以使蛋白酶解更加徹底。酶添加量比例5:5為宜，水解時間比例為1：1，因?yàn)閷Ω髦笜?biāo)的影響較小，可以根據(jù)生產(chǎn)情況而定。
綜合各指標(biāo)分析，分步酶解優(yōu)于單酶酶解，原因可能是堿性蛋白酶為內(nèi)切酶，風(fēng)味蛋白酶為外切酶，將兩種酶相結(jié)合，在各自適宜的條件下進(jìn)行酶解作用，使血紅蛋白酶解更加徹底。同時，風(fēng)味蛋白酶作用于肽鏈末端的肽鍵，酶解產(chǎn)物主要為氨基酸和大分子肽，減少了堿性蛋白酶水解液產(chǎn)生的腥味和苦味。
4結(jié)論
以水解度為指標(biāo)，中性蛋白酶最好，以血紅素為指標(biāo)堿性蛋白酶最好，以苦味值為指標(biāo)，風(fēng)味蛋白酶最好；綜合分析影響分步酶解的因素優(yōu)劣順序?yàn)椋旱孜餄舛?#62;酶解時間>酶添加量比例>酶解時間比例；酶解效果優(yōu)劣順序?yàn)椋悍植矫附夥?#62;單酶酶解法；分步酶解最佳條件為：底物濃度6%，酶解時間10 h，酶添加量比例5:5．酶解時間比例1：1，在此條件下可制備出苦味值較低血紅素含量較高的多肽產(chǎn)物。
5摘要
為制備低苦味血紅素多肽產(chǎn)物，以牛血紅蛋白為原料，在木瓜蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶的最適i濕度13LpH下，通過L，。(4')正交試驗(yàn)進(jìn)行單酶酶解，篩選出分步酶解用酶，并采用Lg(34)正交試驗(yàn)考察了分步酶解過程中底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)、酶添加量比例、水解時間、水解時間比例等因素對水解度、苦味值、血紅素含量等指標(biāo)的影響。結(jié)果表明：分步酶解法酶解效果優(yōu)于單酶酶解法；采用堿性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶進(jìn)行分步酶解，條件在底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)60A，酶添加量比例5:5，酶解時間10 h，酶解時間比例1：1時可獲得苦味值較低的富血紅素多肽產(chǎn)物。
