多位點(diǎn)序列分析在食品用雙歧桿菌分類鑒定中的新用途
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作者：張毅
雙歧桿菌成為近年來食品、藥品研究開發(fā)的熱點(diǎn)，部分菌株大量用于嬰幼兒配方食品、保健食品、藥品的生產(chǎn)中。但雙歧桿菌發(fā)揮有益功能具有很強(qiáng)的菌株特異性，為此FAO/WHO益生菌評價指南中指出，精確的菌株識別是益生菌使用的前提。因此，規(guī)范食品行業(yè)菌種的管理和評價程序，建立準(zhǔn)確、快速的雙歧桿菌鑒定體系非常重要。
16S rDNA基因序列分析是研究分類的重要手段，但對親緣關(guān)系比較近的物種分辨率不高，相對于保守的16S rDNA，部分管家基因(Housekeeping Gene)具有更高的分化程度，使用多位點(diǎn)序列分析( Multi-locus Sequence Analysis，MLSA)的方法對這些管家基因進(jìn)行分析，可以建立比較準(zhǔn)確且可信的物種間關(guān)系，并且通過對雙歧桿菌中管家基因的研究，可以為菌株的快速檢測和鑒定提供基礎(chǔ)。試驗(yàn)采用clpC( coding for a protease),fusA( GTP-binding elongation factor EF-G),gyrB( DNAgyrase, subunit B),ileS( isoleucyl-tRNAsynthetase),purF( amidophosphori-bosyltransferase),rplB( 50S ribosomal subunit proteinL2)和rpoB( beta-subunit of RNA polymerase) 7個管家基因的部分序列對我國法規(guī)規(guī)定允許在食品中使用的5個雙歧桿菌菌種共12株雙歧桿菌菌株進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，為建立準(zhǔn)確、快速的雙歧桿菌鑒定體系提供基礎(chǔ)和線索。由于市場中，乳雙歧桿菌在樣品中添加較為多見，所以試驗(yàn)中使用了多株乳雙歧桿菌。
1 材料與方法
111材料
1.1.1 基因組序列和16S rDNA序列
基于衛(wèi)生部的公告和現(xiàn)有的雙歧桿菌全基因組序列，試驗(yàn)挑選12株雙歧桿菌；12株雙歧桿菌全基因組序列下載于致病系統(tǒng)資源整合中心( Patho Systems Resource Integration Center，PATRIC)，基本信息如表1。
1.1.2管家基因參考序列
7個管家基因的參考序列下載于多位點(diǎn)序列分型( Multi-Locus Sequence Typing，MLST)數(shù)據(jù)庫，參考基因長度分別為：clpC 603 bp，fusA 666 bp，gyrB 627 bp, ileS 489 bp, purF 591 bp, rplB 357 bp以及rpoB 501 bp。
2方法
2.1 管家基因序列識別
使用BLASTv2.2.26將7個管家基因的參考序列比對到12株雙歧桿菌基因組上，使用的E值為le-20，使用自編PERL腳本對基因組中與參考序列比對上的序列進(jìn)行提取，并人工對序列的邊界進(jìn)行確認(rèn)。
2.2系統(tǒng)發(fā)育分析
使用MEGA5分別對16S rDNA、7個管家基因以及管家基因按次序串聯(lián)的序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，系統(tǒng)發(fā)育分析時使用MEGA內(nèi)置的ClustW進(jìn)行序列比對，使用最大似然模型構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹時使用的堿基替換模型為Kimura 2參數(shù)矩陣，使用自舉法（Bootstrap）對系統(tǒng)發(fā)育樹進(jìn)行檢驗(yàn)，檢驗(yàn)時使用的Bootstrap值為1 000。
3結(jié)果
3.1管家基因的基本信息
在12株雙歧桿菌的7個管家基因中，clpC，ileS，purF，rplB和rpoB的基因長度與參考序列長度一致，對于fusA，在B.breve,B.longum subsp. infantis和B.longum subsp. longum中發(fā)現(xiàn)3 bp的缺失，缺失位置在481 bp附近，其他菌株的fusA長度與參考序列一致（圖1A）；
對于gyrB，B．a(chǎn)dolescentis和B．blfidum中發(fā)現(xiàn)3 bp缺失，在B．a(chǎn)dolescentis中，序列缺失位置在312 bp附近，在B．bifidum中，缺失位置在323 bp附近（圖1B）。對于雙歧桿菌屬中B．a(chǎn)nimalis subsp．lactis菌株，5個管家基因序列完全一致，其中ATCC27673菌株與其他5個B．a(chǎn)nimalis subsp. lactis菌株相比，clpC序列上存在微小差異(99.83%)，ileS序列間差異較大(90.49%)。
3.2 16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹
對12株雙歧桿菌的16S rDNA序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，從整體上看，16S rDNA構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹的大部分分支獲得較高的Bootstrap值(>80)，系統(tǒng)發(fā)育樹將12株雙歧桿菌明確地分為兩大分支，一支為B．a(chǎn)nimalis，另一支為B.acbLescentis,B.blfzdum,B.breve和B.longum（圖2）。
3.3單基因系統(tǒng)發(fā)育
通過對管家基因的部分核苷酸序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析后，得到7棵系統(tǒng)發(fā)育樹，從整體上看，7棵系統(tǒng)發(fā)育樹的中均存在較低Bootstrap值(<80)的分支；在這些系統(tǒng)發(fā)育樹中，B．a(chǎn)nimalis subsp. lactis菌株和B．a(chǎn)n-imalis subsp．a(chǎn)nimalis菌株的分類位置在7個基因的系統(tǒng)發(fā)育樹中一致，而其他5個菌株在7棵系統(tǒng)發(fā)育樹中的位置不固定，如在clpC系統(tǒng)發(fā)育樹中，B．longum subsp.infantis與B．longum subsp. longum在同一分支，在usA的系統(tǒng)發(fā)育樹中，B．longum subsp. longum與B．breve在同一分支；其他非B．a(chǎn)nimalis存在同樣的情形（圖3）。
3.4多基因系統(tǒng)發(fā)育樹
將管家基因的序列，按clpC，fusA，gyrB，ileS，purF，rplB和rpoB的順序依次串聯(lián)后，得到串聯(lián)的核苷酸序列，通過對串聯(lián)的核苷酸序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析后，得到基于串聯(lián)序列的系統(tǒng)發(fā)育樹。從整體上看，通過多基因串聯(lián)獲得的系統(tǒng)發(fā)育樹的各個分支均獲得了較高的Bootstrap值(>80)，并且多基因串聯(lián)的系統(tǒng)發(fā)育樹拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)與16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹一致，但具有更高的分辨率（圖4）。
4討論
隨著食品工業(yè)的快速發(fā)展，雙歧桿菌作為益生菌的一大類，已經(jīng)被應(yīng)用于多種食品的添加。然而，益生菌作用具有菌株特異性，精確的菌株識別是益生菌廣泛使用的前提。試驗(yàn)中對衛(wèi)生部65號文《可用于食品的菌種名單》中允許使用的5個雙歧桿菌菌種中12個代表菌株進(jìn)行MLSA分析，比較了7個管家基因間序列差異；并且，試驗(yàn)分別對7個管家基因，管家基因的串聯(lián)序列以及12個雙歧桿菌的16S rDNA序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，為雙歧桿菌的快速鑒定和分類提供依據(jù)。
管家基因序列分析顯示B．breve，B．longum subsp.infantis和B．longum subsp. longum的fusA存在3 bp的缺失；B．a(chǎn)dolescentis和B．bifidum的gyrB存在3 bp缺失；其中B.breve,B.longum subsp. infantis和B.longum subsp.longum缺失位置一致，B．a(chǎn)dolescentis和B．bifidum的缺失為菌種特異性缺失。這一結(jié)果與Alexis Dele'toile等對B.breve,B.longum subsp.infantis,B.longum subsp.longum和B．bifidum等菌株的相應(yīng)基因序列長度的研究結(jié)果一致，B．a(chǎn)dolescentis的缺失則需要進(jìn)一步驗(yàn)證；以上基因片段的缺失信息可以為菌株的快速檢測提供線索。
管家基因系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果說明其序列組成各有特性，部分基因過于保守，如clpC和rplB，使用這些基因構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹時，亞種內(nèi)菌株水平上的系統(tǒng)發(fā)育樹分支獲得的Bootstrap值較低，如B．a(chǎn)nimalissubsp.lactis分支，因此，單獨(dú)使用這些基因可能獲得不準(zhǔn)確的分類結(jié)果；部分基因在菌種間的分化程度較高，如ileS和pruF等，使用這些基因構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹時，盡管亞種內(nèi)菌株水平的系統(tǒng)發(fā)育樹分支獲得較高Bootstrap值，但菌種水平上系統(tǒng)發(fā)育樹分支的Bootstrap值較小，因此，單純使用分化程度較高的基因作為菌種水平上的分類，可能會引入隨機(jī)誤差，造成分類模糊。Sudhindra R．Gadagkar等認(rèn)為，單基因的系統(tǒng)發(fā)育樹只能代表基因在物種間的進(jìn)化關(guān)系，只有多個基因系統(tǒng)發(fā)育分析才能正確反映物種間的關(guān)系。
管家基因串聯(lián)序列的系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果表明，多基因串聯(lián)的系統(tǒng)發(fā)育分析能夠獲得可靠的分支以及穩(wěn)定的分類結(jié)果。試驗(yàn)中多個管家基因串聯(lián)的系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果能夠在亞種的水平上將雙歧桿菌進(jìn)行分類，并且系統(tǒng)發(fā)育樹中的各個分支均獲得較高的Bootstrap值。多基因系統(tǒng)發(fā)育樹的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)與基于16S rDNA的系統(tǒng)發(fā)育樹的一致，并且多基因系統(tǒng)發(fā)育樹具有更高的分辨率；試驗(yàn)中使用的多基因系統(tǒng)發(fā)育分析，可以為將來亞種水平上雙歧桿菌的分類提供了參考和線索。盡管使用多基因串聯(lián)的方式進(jìn)行分析仍然無法有效區(qū)分6個B．a(chǎn)nimalis subsp. lactis菌株，這提示我們，B．a(chǎn)nimalis subsp. lactis亞種內(nèi)基因組序列特別保守，單純的從基因的角度可能無法在雙歧桿菌的亞種內(nèi)對菌株進(jìn)行分類，所以需要探索更加精確的分類方法，如全基因組測序，全基因組水平的單核苷酸多態(tài)性，結(jié)合生理生化指標(biāo)等。
未來的雙歧桿菌分類鑒定中，使用全基因組測序的方式將成為重要的發(fā)展方向，特別是對于一些使用傳統(tǒng)的16S rDNA序列分型方式無法被準(zhǔn)確分類的菌株。但是目前，由于成本和周期等原因，全基因組測序尚無法被應(yīng)用于雙歧桿菌的快速鑒定和分類，所以從全基因組水平上篩選更多合適的基因用于雙歧桿菌菌株鑒定和分類，是重要和可行的研究方向之一。
5結(jié)論
在12株雙歧桿菌中，B．breve，B．longum subsp.infantis.B.longum subsp. longum,B.adolescentis和B.bifidum中片段缺失可以為這些菌株的快速鑒定提供線索；使用7個管家基因串聯(lián)序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹與基于16S rDNA構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹具有一致的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，并且多管家基因系統(tǒng)發(fā)育樹具有更高的分辨率。
6摘要
雙歧桿菌是一類被廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)的益生茵，準(zhǔn)確、快速地分類和鑒定雙歧桿菌對其應(yīng)用和管理具有重要意義。選擇了可在食品中使用的雙歧桿菌菌種中的12個代表菌株，使用多位點(diǎn)分析的方法對其16S rDNA和7個管家基因進(jìn)行研究，從系統(tǒng)發(fā)育的角度討論利用多基因串聯(lián)的方式對雙歧桿菌屬建立穩(wěn)定可靠的分類方法的可行性。研究發(fā)現(xiàn)雙歧桿菌屬中部分菌株存在特異性序列缺失，可以為菌株的快速檢測提供線索；多基因系統(tǒng)發(fā)育分析較16S rDNA分析方法分辨力更高，可應(yīng)用于食品中雙歧桿菌的分類鑒定。
