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  作者：張毅  

     花色苷是花青素與糖類物質(zhì)以糖苷鍵結(jié)合而成的一類化合物，為蔬菜、水果等食物中所含的天然色素，屬植物化學(xué)成分中的黃酮類化合物，具有抗氧化[2]、抗炎癥[3]、抗腫瘤[4]、抗動(dòng)脈粥樣硬化[5]等優(yōu)異生物活性，已被廣泛用于食品、保健品、化妝品、醫(yī)藥等行業(yè)。紫扁豆中的色素主要為花色苷，人們可經(jīng)日常食用途徑攝入而起到一定的保健功能。大孔樹脂因其理化性質(zhì)穩(wěn)定、分離性能優(yōu)良、溶劑用量少等優(yōu)點(diǎn)而應(yīng)用于天然植物活性成分的分離純化[6-7]，利用大孔吸附樹脂純化天然植物花色苷多見于紫甘薯[8]、紫甘藍(lán)[9]、藍(lán)莓果等[10] 叫紫紅色果蔬。目前，關(guān)于紫扁豆花色苷純化方的研究鮮見報(bào)道。試驗(yàn)以紫扁豆為原料，對(duì)紫扁豆花色苷純化樹脂的篩選及樹脂吸 附-解吸性質(zhì)進(jìn)行研究，探討DM-28樹脂分離純化紫扁豆花色苷的工藝條件，旨在為人們深入了解紫扁豆的食用價(jià)值或開發(fā)利用提供理論依據(jù)和科學(xué)參考。

  1  材料與方法

  1.1試驗(yàn)材料

    紫扁豆：市售，干燥粉碎后備用。 試劑：無(wú)水乙醇、鹽酸、氫氧化鈉、氯化鉀、醋

  酸鈉：均為分析純?cè)噭�；樹脂：AB-8，X—5, DM- 20，DM-21，DM-21D，DM-28，DM-2:山東魯抗立 科藥業(yè)有限公司。

  1.2儀器與設(shè)備

    Q-350B3型高速粉碎機(jī)：上海冰都電器有限公 司；GPX-9248A型干燥箱：上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限 公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋：常州國(guó)華電器有限公 司；FA2104V型電子天平：上海青浦儀器有限公司； V-5600型可見分光光度計(jì)：上海元吸儀器有限公司： SHZ-D型循環(huán)水式真空泵：鞏義市予華儀器有限責(zé)任 公司；TDL-5-A型低速大容量離心機(jī)：上海安亭科學(xué) 儀器廠。

  2試驗(yàn)方法

  2.1  紫扁豆花色苷粗提物的制備流程

    紫扁豆->烘干->粉碎->醇提->抽濾->旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)->定容

2.2花色苷含量測(cè)定

2.2.1  緩沖液的配制

    pH 1.0緩沖液：稱取1.49 g KC1定容100 mL，1.7 mL HCI定容100 mL．KC1與HCI體積比25：67配置。pH 4.5緩沖液：稱取2.72 g NaAc．3H20定容100 mL，HCI調(diào)pH。

2.2.2紫扁豆花色苷最大吸收波長(zhǎng)的確定

    取一定量紫扁豆提取液用酸性乙醇溶液稀釋至一定體積，使其吸光度在一定范圍內(nèi)，在400—600 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描，繪制吸收光譜圖曲線。

2.2.3花色苷含量的測(cè)定

    采用pH示差法[11-12]，移取2 mL待測(cè)液分別用pH1.0和pH 4.5的緩沖液定容到10 mL，放置一定時(shí)間平衡后[13] ，波長(zhǎng)538 nm和700 nm處測(cè)定吸光度。

Mw-矢車菊花素-3-葡萄糖苷的相對(duì)分子質(zhì)量449.2：

• -矢車菊花素-3-葡萄糖苷消光系數(shù)26 900; 1-光程1 cm；Df-稀釋因子；V-最終體積，mL。

2.3樹脂篩選

2.3.1樹脂預(yù)處理

    將大孔樹脂AB-8，DM-21，DM-28，DM-21D,DM-2，DM-20和X-5用95%乙醇浸泡，不斷攪拌，除去氣泡后裝入柱中。用3倍柱床體積( BV) 95%乙醇洗脫，洗至洗脫液透明無(wú)醇味且蒸干后無(wú)殘?jiān)�（或極少殘?jiān)�）。再依次�? BV 5%NaOH溶液浸泡后蒸餾水洗至pH為中性，2 BV的4%鹽酸浸泡并以蒸餾水洗脫至pH中性，備用。

  2.3.2不同樹脂靜態(tài)吸附和解吸性能比較

    分別稱取已活化處理的七種樹脂0.5 g于250 mL錐形瓶中，加入pH 3質(zhì)量濃度為0.171 9 mg/mL花色苷粗提液50 mL，蓋緊瓶塞。室溫(15 0C)靜置24 h吸附飽和，吸取上清液測(cè)定其吸光度A1，計(jì)算其靜態(tài)吸附率。將吸飽樹脂用蒸餾水沖洗后抽濾去大部分水分，各稱取0.5 g置于250 mL錐形瓶中，加入50 mL pH 3.0的80%乙醇溶液解吸24 h，吸取上清液測(cè)定其吸光度

A2，計(jì)算其靜態(tài)解吸率。

    吸附率=（初始花色苷含量-吸附后花色苷含量）／初始花色苷含量×100%    (2)

    解吸率=解吸液花色苷含量／吸附花色苷含量×100%    (3)

2.4樹脂靜態(tài)吸附-解吸試驗(yàn)

2.4.1樹脂靜態(tài)吸附試驗(yàn)

    稱取已處理的DM-28樹脂0.5 g于250 mL具塞錐形瓶中，加入50 mL不同濃度和pH的色素稀釋液，在不同溫度，時(shí)間下進(jìn)行吸附，分別考察樣液濃度，樣液pH，時(shí)間和溫度對(duì)吸附率的影響。

2.4.2 DM-28樹脂靜態(tài)吸附條件優(yōu)化

    選擇對(duì)大乳樹脂吸附效果較好的3個(gè)因素安排L9(34)正交試驗(yàn)，以吸附率為指標(biāo)，對(duì)DM-28樹脂吸附紫扁豆花色苷的條件進(jìn)一步優(yōu)化。正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平表見表1。

2.4.3樹脂靜態(tài)解吸試驗(yàn)

    過濾最佳吸附條件下吸附飽和的樹脂，用50 mL不同乙醇濃度和不同pH的乙醇溶液解吸，分別考察解吸液濃度和解吸液pH對(duì)解吸率的影響。

2.5樹脂動(dòng)態(tài)吸附-解吸條件研究

    取一定量濕樹脂裝柱，用不同的吸附流速，樣液濃度上樣，每3 mL收集流出液并測(cè)定其吸光度，當(dāng)達(dá)到泄漏點(diǎn)時(shí)，停止吸附進(jìn)樣，考察不同上樣流速，樣液濃度對(duì)單位樹脂色素飽和吸附量和上樣時(shí)間的影響。吸附飽和的樹脂柱用2 BV/h的蒸餾水洗去殘留的糖分。用不同濃度，pH的洗脫劑在不同洗脫流速下洗脫，每3 mL收集色素洗脫液，確定其最適宜的洗脫劑濃度、洗脫劑pH和洗脫流速。

2.6色價(jià)的測(cè)定

    稱取適量干燥的紫扁豆花色苷，用pH 3.0的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液稀釋定容至100 mL，用1 cm比色皿以緩沖溶液作空白，在最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。

    式中：A-最大吸收波長(zhǎng)處吸光度；m-稱取樣品的質(zhì)量，g。

1 3結(jié)果與分析

1 3.1紫扁豆花色苷提取液光譜掃描圖譜

    紫扁豆花色苷提取液經(jīng)紫外可見分光光度計(jì)掃描后的光譜圖見圖1。由圖1可知紫扁豆花色苷的最大吸收波長(zhǎng)為538 nm。

3.2最佳樹脂的篩選

  由表2可知，七種大孔樹脂對(duì)紫扁豆花色苷都有一定的吸附能力，其中DM-28的吸附率和解吸率均高于其它六種大孔樹脂，綜合考慮吸附和解吸兩方面的因素，確定DM-28為試驗(yàn)的最佳樹脂。

3.3樹脂靜態(tài)吸附性能試驗(yàn)

3.3.1 pH、濃度、溫度和時(shí)間對(duì)吸附的影響

    國(guó)內(nèi)學(xué)者王京亭[14] 認(rèn)為，在不同的pH條件下，花色苷主要存在氧鎓鹽，醌式堿，甲醇假堿和查爾酮四種結(jié)構(gòu)，且四種結(jié)構(gòu)隨pH變化呈現(xiàn)不同的平衡狀 態(tài)。強(qiáng)酸和弱酸溶液中分別以紅色的氧翁鹽陽(yáng)離子和紫紅色脫水堿基陰離子存在，中性溶液中以無(wú)色假堿結(jié)構(gòu)為主，堿性溶液中主要為藍(lán)色醌式堿。試驗(yàn)中pH1.0～5.0對(duì)花色苷吸附的影響結(jié)果如圖2 (a)所示，pH在4.0之前吸附率先升高后稍有下降，卻在pH為5.0時(shí)吸附率達(dá)最大，其原因可能是隨著溶液酸性的減弱，紫扁豆花色苷結(jié)構(gòu)更趨于轉(zhuǎn)化為脫質(zhì)子化的醌型堿，且結(jié)構(gòu)變化后使溶液中花色苷在固定波長(zhǎng)下的吸收有所變小，致使紫扁豆花色苷的吸光度在吸附前后的差值增大，使pH 5.0時(shí)在表觀上吸附率達(dá)到了最大值�？紤]到溶液花色苷的穩(wěn)定性，確定溶液pH 3.0為較適合吸附條件。

    由圖2 (b)不同溶液質(zhì)量濃度對(duì)吸附效果的影響可知，隨著稀釋倍數(shù)的增大，吸附率逐漸下降，即在溶液濃度最大時(shí)吸附效果最好，所以確定0.554 4 mg/mL的原液為溶液吸附質(zhì)量濃度。

    不同溫度下DM-28對(duì)紫扁豆花色苷吸附效果如圖2 (c)所示，在相對(duì)較低的溫度下，溫度上升有利于樹脂對(duì)花色苷的吸附，繼續(xù)升溫其吸附率略有下降，原因可能是溫度升高可加快分子運(yùn)動(dòng)而使分子相對(duì)難以在樹脂表面吸附，且溫度升高可能對(duì)花色苷的穩(wěn)定性造成-的影響，因此，確定吸附溫度40℃較好。

    吸附時(shí)間對(duì)吸附率的影響如圖2 (d)所示，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)紫扁豆花色苷吸附率逐漸增大，在180 min后吸附率變化不大，即在此時(shí)樹脂已基本吸附飽和，所以確定吸附時(shí)間為180 min。

3.3.2紫扁豆花色苷靜態(tài)吸附正交試驗(yàn)結(jié)果

    由表3正交試驗(yàn)結(jié)果可知，各因素對(duì)紫扁豆花色苷吸附影響程度依次為吸附pH>吸附時(shí)間>吸附溫度，最佳組合為A3B3C2，吸附率達(dá)89.92%,但與極差分析所得最優(yōu)水平組合A2B3C2不符，因此對(duì)A3B3C2和A2B3C2進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。表4結(jié)果顯示各因素的水平之間均無(wú)顯著性差異。

3.3.3優(yōu)化條件的驗(yàn)證及重現(xiàn)性試驗(yàn)

    表5和表6結(jié)果表明，A3B3C2為最佳吸附條件，即吸附溫度50℃，樣液pH 4.0，時(shí)間180 min;按A3B3C2進(jìn)行平行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示試驗(yàn)結(jié)果的變異系數(shù)僅為0.91%，表明重現(xiàn)性好，所得最優(yōu)條件組合正確可行。

3.4樹脂靜態(tài)解吸性能實(shí)驗(yàn)

    酸性條件下乙醇溶液pH對(duì)花色苷解吸效果如圖3 (a)所示，隨pH升高，解吸率逐漸減小，pH為1.0時(shí)解吸效果最佳。這可能是在pH 1.0的溶液中紫扁豆花色苷主要以極性較大的氧翁鹽陽(yáng)離子形式存在，非極性DM-28樹脂對(duì)其吸附相對(duì)較弱，因此酸性較強(qiáng)（極性較大）的乙醇溶液相對(duì)更易將花色苷洗脫。故在此條件下，選用pH 1.0的乙醇溶液為靜態(tài)解吸的最適pH。由圖3(b)可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)在60%和80%時(shí)所得解吸率較高，通過可見分光光度計(jì)測(cè)定兩個(gè)體積分?jǐn)?shù)解吸液透光率發(fā)現(xiàn)，80%乙醇洗脫的解吸液較混濁，透光率較低，導(dǎo)致吸光度明顯偏高�？赡芤�?yàn)?0%乙醇洗脫能力較強(qiáng)，吸附在樹脂上的醇溶性雜質(zhì)被大量洗脫，所測(cè)吸光度偏高在表觀上具有高解吸率，鑒于此，選定60%乙醇為最佳的解吸體積分?jǐn)?shù)。

3.5動(dòng)態(tài)吸附與解吸性能

3.5.1動(dòng)態(tài)下上樣質(zhì)量濃度和上樣流速對(duì)吸附率的影響

    上樣質(zhì)量濃度是影響樹脂吸附性能的重要因素之一。樹脂吸附容量一般以較低濃度進(jìn)行較為有利。如果原液濃度偏高，則泄漏點(diǎn)早，處理量小，樹脂使用周期短，樹脂再生次數(shù)增多；如果原液質(zhì)量濃度偏低，工作效率降低。由圖4可知，選擇稀釋倍數(shù)為2，即質(zhì)量濃度0.277 2 mg/mL為最佳質(zhì)量濃度。由表7可知，流速在1.0～3.0 mL/min時(shí)吸附量隨流速的增大而下降，流速過大，使樹脂的吸附量下降，提早泄漏；流速較小時(shí)，雖然樹脂吸附量較多，但會(huì)造成生產(chǎn)周期長(zhǎng)，生產(chǎn)效率低，因此選擇上樣流速為1.5 mL/min。

3.5.2動(dòng)態(tài)下洗脫液pH、乙醇體積分?jǐn)?shù)和洗脫流速對(duì)解吸率的影響

    靜態(tài)吸附試驗(yàn)可知，在pH 5.0時(shí)，紫扁豆花色苷可能轉(zhuǎn)化為醌型堿結(jié)構(gòu)使其穩(wěn)定性下降，并導(dǎo)致其在固定波長(zhǎng)下的吸光度變小等不利影響，為此，選擇使花色苷結(jié)構(gòu)保持穩(wěn)定的pH 1.0～3.0為解吸條件進(jìn)行試驗(yàn)。圖5 (a)結(jié)果表明，隨pH的增加解吸率呈下降趨勢(shì)，在pH 1.0時(shí)解吸最好，結(jié)果與靜態(tài)洗脫相一致。由圖5 (b)可以看出，pH1.0的不同體積分?jǐn)?shù)乙醇溶液對(duì)DM-28樹脂上花色苷的解吸能力呈先升后降的趨勢(shì)，以60%乙醇洗脫時(shí)，解吸率最大，且60%乙醇洗脫時(shí)，洗脫速度較快，能將樹脂吸附的花色苷基本洗脫，所得洗脫液清澈透明，故60%乙醇溶液為合適的洗脫劑。圖5 (c)顯示洗脫流速對(duì)樹脂動(dòng)態(tài)解吸性能的影響，動(dòng)態(tài)下極性較大的60% pH 1.0的乙醇溶液對(duì)吸附較弱但極性相對(duì)較大的花色苷氧鎓陽(yáng)離子具有較強(qiáng)的洗脫能力，隨著洗脫流速的增大，解吸率逐漸增大，且在流速達(dá)到3 mL/min時(shí)解吸率急劇上升，但此時(shí)觀察到洗脫液渾濁，可能是流速過大使一些吸附于樹脂上的非花色苷類物質(zhì)被洗脫下來。從純度和效率綜合考慮，選擇洗脫流速為2.5 mL/min。

3.6色價(jià)的測(cè)定結(jié)果

    紫扁豆花色苷純化前色價(jià)為2.1，純化后的色價(jià)為14.06，是純化前的6.7倍，DM-28樹脂對(duì)紫扁豆花色苷具有較好的純化效果。

4結(jié)論

從七種大孔樹脂中篩選出DM-28型大孔樹脂是純化紫扁豆花色苷較適合的樹脂類型。通過單因素和正交試驗(yàn)，優(yōu)選出DM-28型大孔樹脂的最佳靜態(tài)吸附工藝條件為：樣液質(zhì)量濃度為0.554 4 mg/mL，樣液pH 4.0，溫度50℃，時(shí)間180 min，在此條件下，吸附率可以達(dá)到89.92%；并在pH 1.0，60%乙醇溶液中解吸效果最好。DM-28型大孔樹脂對(duì)紫扁豆花色苷動(dòng)態(tài)吸附-解吸最適工藝條件為：上樣液流速1.5 mL/min，上樣液質(zhì)量濃度0.277 2 mg/mL，洗脫劑體積分?jǐn)?shù)60%，洗脫流速2.5 mL/min，洗脫劑pH 1.0。經(jīng)過大孔樹脂的富集，可以在一定程度上將提取液中的糖類及無(wú)機(jī)鹽類除去，紫扁豆花色苷純化后的色價(jià)為14.06，是純化前的6.7倍。說明DM-28大孔樹脂對(duì)花色苷類化合物有較好的富集純化效果，具有一定的應(yīng)用價(jià)值。

摘  要 

 比較了七種大孔樹脂對(duì)紫扁豆花色苷的靜態(tài)吸附-解吸特性，研究了DM-28大孔樹脂對(duì)紫扁豆花色苷靜態(tài)、動(dòng)態(tài)吸附-解吸工藝條件。結(jié)果表明：DM-28大孔樹脂為純化紫扁豆花色苷的最佳樹脂；靜態(tài)吸附-解吸最佳條件為：樣液質(zhì)量濃度0.554 4 mg/mL，樣液pH 4.0，吸附溫度40 0C，吸附時(shí)間180 min,在pH 1.0, 60%乙醇溶液條件下 解吸：動(dòng)態(tài)吸附一解吸最適工藝條件為：上樣質(zhì)量濃度0.277 2 mg/mL、上樣流速1.5 mL/min，以流速2.5 mL/min, pH 1.0的600A乙醇洗脫。純化后花色苷色價(jià)為14.06，為純化前的6.7倍。