理論與實踐:響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波輔助提取1 20℃壓榨紫蘇餅蛋白工藝
相關(guān)鏈接： 中國安全網(wǎng) 中國質(zhì)量網(wǎng) 中國論文網(wǎng) 中國資訊網(wǎng)
作者：鄭曉敏
近些年來，紫蘇作為新型保健植物油資源，越來越受到重視，其開發(fā)利用研究正成為世界熱點。紫蘇籽蛋白質(zhì)含量為20%—23%，紫蘇餅是紫蘇籽提油后的副產(chǎn)品，氣味芳香，適口性好，120℃壓榨法脫脂后紫蘇餅中粗蛋白含量（N×6.25，干基）可達31.22%。目前，紫蘇餅大多數(shù)只是作為飼料或肥料，有效利用紫蘇粕資源，開發(fā)紫蘇蛋白產(chǎn)品十分必要。超聲波具有波動和能量兩種屬性，對物質(zhì)有空化效應(yīng)和機械作用，能顯著提高細胞內(nèi)容物的提取率。
因此，試驗以堿溶酸沉法從經(jīng)超聲波處理的高溫壓榨脫脂紫蘇餅中提取蛋白質(zhì)，觀察超聲波處理對蛋白質(zhì)提取率的影響，為用高溫壓榨脫脂紫蘇餅提取蛋白質(zhì)提供依據(jù)。采用超聲波輔助堿溶酸沉法，通過在不同超聲波功率、超聲波時間、料液質(zhì)量比、堿提溫度、堿提時間和堿提pH的條件下提取紫蘇蛋白的研究，確定最佳工藝條件，為紫蘇蛋白資源的開發(fā)利用提供技術(shù)依據(jù)。
1 材料與方法
1.1材料與試劑
壓榨紫蘇餅：吉林沃達食品有限公司；牛血清蛋白、濃鹽酸、氫氧化鈉、硫酸銅、濃硫酸、四氯化碳、酒石酸鉀、甲基紅，均為市售分析純：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。
1.2儀器與設(shè)備
AY120型島津托盤電子分析天平：日本島津制作所；Sigma l-14K高速冷凍離心機：德國SIGMA公司；IKA All小型冷凍粉碎機：德國IKA集團；101A-3型電熱鼓風(fēng)干燥箱：上海實驗儀器廠；HF-2.OB型超聲循環(huán)提取機：北京弘祥隆生物技術(shù)開發(fā)有限公司；FW-80萬能粉碎機：上海仕元科學(xué)器材有限公司；22PC可見分光光度計：上海棱光技術(shù)有限公司；HH-S恒溫水浴鍋：江蘇省金壇市環(huán)宇科學(xué)儀器廠；SHB-3循環(huán)水多用真空泵：廣州市深華生物技術(shù)
有限公司；PHS-802酸度計：北京華瑞博遠科技發(fā)展有限公司。
1.3試驗方法
1.3.1工藝流程
脫脂紫蘇餅→加水?dāng)嚢?#8594;超聲波處理→N aoH溶液調(diào)節(jié)pH→攪拌→離心分離→蛋白質(zhì)溶液→鹽酸調(diào)節(jié)至等電點→離心分離→干燥→紫蘇蛋白
1.3.2可溶性蛋白質(zhì)的測定
1.3.2.1雙縮脲試劑的配制
取1.5 g硫酸銅和6.0 g酒石酸鉀鈉溶于500 mL蒸餾水中，加入300 mL的10% NaOH溶液并攪拌，用蒸餾水定容至1000 mL即可，此試劑可長期保存。
1.3.2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
牛血清白蛋白( BSA)用0.9% NaCl溶液配制成10 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液。取6只10 mL試管并編號，分別加入0，0.2，0.4, 0.6，0.8和1.0 mL牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液，用蒸餾水補足至1.0 mL，然后各加入雙縮脲試劑4.0 mL，旋渦混合器混勻1 min，在室溫下放置30 min，于540 nm處，以蒸餾水作參比，進行比色測定，以牛血清白蛋白質(zhì)量濃度( mg/mL)為橫坐標(biāo)(X)，吸光度A為縱坐標(biāo)(Y)繪制濃度一吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。
采用最小二乘法估計標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程為y=0.043 7x+0.066 9．相關(guān)系數(shù)R=0.998 8�？梢钥闯龃藰�(biāo)準(zhǔn)曲線比較理想，回歸方程（即標(biāo)準(zhǔn)曲線方程）具有很好的相關(guān)性，可以應(yīng)用。
1.3.2.3 樣液測定
取樣品溶液1.0 mL置容量瓶內(nèi)，加入1.0 mLCCI4，加入雙縮脲試劑3.0 mL，旋渦混合器混勻1 min，在室溫下放置30 min后，4 000 r/min離心10mm，取上清液于540 nm處，以蒸餾水作參比，進行比色測定，對照標(biāo)準(zhǔn)曲線方程求得樣品溶液蛋白質(zhì)的濃度。以雙縮脈法測定的堿提離心后上清液，提取液蛋白質(zhì)濃度計算紫蘇餅蛋白質(zhì)的提取率，計算方法為：
2結(jié)果與分析
2.1單因素試驗
2.1.1超聲時間對紫蘇餅蛋白提取率的影響
從圖2可知，在超聲波處理時間10—30 min范圍內(nèi)，紫蘇餅蛋白的提取率隨時間增加呈上升趨勢，在10—20 min．提取率增加迅速。當(dāng)超過15 min后，隨時間延長，紫蘇餅蛋白提取率迅速下降�？赡苁怯捎诔曁崛r間過長，導(dǎo)致整個反應(yīng)系統(tǒng)內(nèi)部溫度逐漸上升，最終導(dǎo)致一部分蛋白發(fā)生變性。圖2表明，在超聲波處理15 min時，蛋白提取率達到26.8%，故超聲波處理時間選擇15 min。
2.1.2料液質(zhì)量比對紫蘇餅蛋白提取率的影響
在超聲波功率180 W，超聲時間15 min，堿提溫度40℃，堿提pH 9的條件下，研究不同料液質(zhì)量比對紫蘇餅蛋白提取率的影響，由圖3試驗結(jié)果可知，隨著料液質(zhì)量比的增加，紫蘇餅蛋白提取率快速上升，在料液質(zhì)量比1: 20時達到最高。其原因是對紫蘇餅中蛋白質(zhì)的浸提已趨于平衡，即便增大料液質(zhì)量比也不可能提高產(chǎn)品蛋白質(zhì)含量。因此，選取料液質(zhì)量
比1：18—1：22作為制備紫蘇分離蛋白正交試驗的水平。
2．1.3堿提溫度對紫蘇餅蛋白提取率的影響
由圖4可以看出，25℃—40 ℃之間，隨著溫度提高紫蘇餅蛋白質(zhì)提取率提高。40℃以后提取率稍有下降，紫蘇餅蛋白提取率呈急劇下降趨勢。原因是由于隨著溫度的升高，蛋白質(zhì)在45℃—60℃易受熱變性，使蛋白質(zhì)提取率下降，蛋白質(zhì)變性影響產(chǎn)品的功能性，而且黏度增大，分離困難，凈能耗也增加，故本工藝的溫度控制在40℃左右為佳。
2．1.4堿提pH對紫蘇餅蛋白提取率的影響
由圖5可見，隨堿溶pH的增大，產(chǎn)品蛋白質(zhì)提取率呈先上升后下降趨勢。隨著pH的增加，蛋白質(zhì)帶的電荷增多，蛋白質(zhì)一水的相互作用增大，蛋白質(zhì)一蛋白質(zhì)之司的作用減小。當(dāng)pH繼續(xù)升高到10以上時，少量蛋白質(zhì)可能發(fā)生極端變性，蛋白質(zhì)含量略有下降。因此，
選取pH 8—10作為制備紫蘇餅蛋白正交試驗的水平。
2.2響應(yīng)面設(shè)計結(jié)果與分析
基于單因素試驗設(shè)計，對優(yōu)化工藝條件進行了一系列的試驗，根據(jù)Box-Benhnken的中心組合試驗設(shè)計原理。利用Design-Expert 8.0.6進行響應(yīng)面法( Response Surface Methodology( RSM))優(yōu)化影響紫蘇餅粕蛋白提取率的四個主要因素：超聲波時間（x1）、料液質(zhì)量比( X2)、堿提溫度(X3)、堿提pH進行優(yōu)化組合�？疾炷繕�(biāo)為提取率，試驗因素水平安排以及根據(jù)以上水平編碼設(shè)計試驗表格并檢測響應(yīng)值，結(jié)果見表1。
對表1數(shù)據(jù)進行二次多元回歸擬合，可求出影響因素的一次效應(yīng)、二次效應(yīng)以及交互效應(yīng)的關(guān)聯(lián)方程并可繪制出響應(yīng)面圖。該模型通過二階經(jīng)驗?zāi)Ｐ蛯ψ兞康捻憫?yīng)行為進行表征，即：
式中，Y-響應(yīng)值；β0、,βi、,βii一表示偏移項、線性偏移、二階偏移系數(shù)；盧，，一交互效應(yīng)系數(shù)；xi各因素的編碼值。對表1試驗數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合得到感官評分(Y)對編碼自變量xl、X2和X3的二次多項式回歸方程。
Y=2 8.60- 1.3 0xl-0.63x2-0.1 3x3+0.5 9x4-0.15xlx2+0.15x1X 3+0.063x1X4-0.5 0X 2X3- 1.5 0x2x4+0.3 9X 3X4- 3.21x12_3.43x22_3.02x32-2.OOx42
表2結(jié)果表明，模型是顯著的(P<0.05)，R2=0.705 7．R2Adj=0.411 3，R2pred=-0.695 4，模型變異系數(shù)為9.99%，精密度為5.090，說明模型準(zhǔn)確度和精密度都較高，用該模型進行分析和預(yù)測是合理的。
由表2可知，一次項x4顯著，由F值和Prob>F可知，單因素的影響順序為X1>X4>X2>X3．超聲波時間>堿提pH>料液質(zhì)量比>堿提溫度；二次項x12，X22，x32高度顯著。
2.3 回應(yīng)曲面分析
響應(yīng)面曲面的坡度可反映該因素對蛋白質(zhì)提取率影響的強弱程度。響應(yīng)曲面相對平緩，說明其可容忍處理條件的影響。由圖6 (a)得，在超聲波時間x1與料液x交互作用響應(yīng)曲面中，曲面坡度沿X2軸方向變化的趨勢明顯高于x1，說明因素料液質(zhì)量比對紫蘇餅粕蛋白質(zhì)提取率的變化比超聲波作用時間的變化敏感。圖6(b)中曲面坡度沿軸x1方向變化顯著，說明在超聲波時間和堿提溫度的相互作用中，超聲波時間對紫蘇餅粕蛋白質(zhì)的提取率的變化比堿提溫度變化敏感。由圖6 (c)可以看出堿提pH的曲面坡度變化明顯高于超聲波時間方向的變化，說明堿提pH對響應(yīng)值的影響要遠遠大于超聲波時間的影響。圖6(d)中的曲面坡度變化趨勢顯示其沿X2方向變化的趨勢要相對高于x3方向的變化，料液質(zhì)量比對紫蘇蛋白質(zhì)提取率的變化比堿提溫度的變化敏感。圖6 (e)中的曲面坡度變化趨勢顯示其沿x4方向變化的趨勢要相對高于X2方向的變化，堿提pH對紫蘇餅粕蛋白質(zhì)提取率的變化比料液質(zhì)量比變化敏感。圖6 (f)中的曲面坡度變化趨勢顯示其沿x4方向變化的趨勢要相對高于x3方向的變化，堿提pH對紫蘇餅粕蛋白質(zhì)提取率的變化比堿提溫度的變化敏感。
2.4最佳條件的確定
為了確定最佳工藝配方條件，對回歸方程取一階偏導(dǎo)數(shù)等于零解方程組得x1=-0.197 66，X2=-0.129 39，X3=-0.003 27和X4=0.192 588，此時Y=28.826 26%。
即紫蘇餅粕蛋白提取的最佳工藝參數(shù)為超聲波時間14.407 03 min、料液質(zhì)量比為1：17.741 23、堿提溫度為39.967 25℃、堿提pH為9.592 588。為檢驗響應(yīng)曲面法所得結(jié)果的可靠性，采用最佳提取工藝條件進行紫蘇餅粕蛋白粉脫臭加工，考慮到實際操作的便利，將工藝參數(shù)修正為：超聲波時間15 min、料液質(zhì)量比為1：18、堿提溫度為40℃、堿提pH為9.6。
3結(jié)論
在單因素試驗的基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面法對超聲波輔助提取紫蘇餅蛋白提取效果有影響的各個因素，既省時也可同時比較分析各因素之間的交互作用，保證了試驗的精確性。并通過Box-Behnken中心組合試驗，建立了紫蘇餅粕蛋白質(zhì)提取相互作用的二階多項式回歸模型。對回歸模型進行統(tǒng)計分析，獲得最優(yōu)化工藝。超聲輔助提取紫蘇餅粕蛋白質(zhì)的最佳工藝條件為：超聲波時間15 min、料液質(zhì)量比1：18、堿提溫度40℃、堿提pH 9.6；在此條件下，紫蘇餅粕蛋白質(zhì)提取率為28.826 26%，與理論值基本相符。因此，利用響應(yīng)面分析方法對超聲波輔助提取紫蘇餅蛋白工藝進行優(yōu)化，可以獲得最優(yōu)的工藝參數(shù)，這為進一步試驗研究奠定了基礎(chǔ)。
4摘要
以120℃壓榨紫蘇餅為原料，采用超聲波技術(shù)輔助提取紫蘇餅蛋白質(zhì)，考察了超聲時間、料液質(zhì)量比、堿提溫度和堿液pH對紫蘇餅蛋白質(zhì)提取率的影響，并以響應(yīng)曲面法優(yōu)化工藝條件；結(jié)果表明，超聲波輔助提取紫蘇餅蛋白質(zhì)最佳提取工藝條件為：超聲時間15 min、料液質(zhì)量比1：18、堿提溫度40℃、堿提pH 10，在此條件下，紫蘇餅蛋白質(zhì)一次提取率為28.826 26%。
