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    作者：鄭曉敏

    目前區(qū)分解凍肉與新鮮肉的方法包括酶DNA檢測(cè)法、波譜檢測(cè)法、生物成像法和酶法檢測(cè)。利用衛(wèi)星測(cè)定方法可以檢測(cè)新鮮雞肉的DNA狀態(tài)，并可了解微生物污染情況，是一種快捷便宜的方法。波譜法研究主要采用近紅外光譜法對(duì)肉品進(jìn)行觀察研究，在肉品的存貯過(guò)程中，脫氧肌紅蛋白、高鐵肌紅蛋白和氧合肌紅蛋白會(huì)發(fā)生不同的變化，科學(xué)家利用光譜手段對(duì)各種肉品進(jìn)行考察，試圖找出區(qū)分新鮮肉／解凍肉的方法。生物成像法則通過(guò)顯微鏡成像或掃描電鏡成像等方法直接觀察肉品細(xì)胞的微觀結(jié)構(gòu)，根據(jù)樣本微觀結(jié)構(gòu)與新鮮肉品的差異，判定是否曾經(jīng)存在冰晶，進(jìn)而判別是否為解凍肉品。HADH酶活鑒別動(dòng)物組織是否經(jīng)過(guò)冷凍處理的方法，由于該方法的有效性及商業(yè)價(jià)值，在上世紀(jì)90年代后許多學(xué)者對(duì)其進(jìn)行了深入的研究。已經(jīng)公布的研究對(duì)象范圍多集中在水產(chǎn)品、蛙肉組織等，發(fā)現(xiàn)至昏處理或碎冰保存的加工方式不能改變牛蛙腿肉HADH酶活，而冷凍處理則明顯影響其HADH酶活。由于國(guó)內(nèi)外養(yǎng)殖方法、地域和樣品種類(lèi)等存在差異，不能簡(jiǎn)單根據(jù)文獻(xiàn)中酶活值高低判斷樣品是否經(jīng)過(guò)冷凍。因此，試驗(yàn)以對(duì)蝦和蝦姑為研究對(duì)象，建立根據(jù)HADH酶活值高低判別新鮮蝦與解凍蝦的方法，為如何判別新鮮水產(chǎn)品與解凍水產(chǎn)品提供參考，為進(jìn)一步的深入研究提供理論依據(jù)。

1  材料與方法

1.1試驗(yàn)材料與儀器

    新鮮活對(duì)蝦、新鮮活蝦姑：市售；NADH、EDTA、Acetoacetyl-CoA標(biāo)準(zhǔn)品：購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；其它試劑均為常規(guī)試劑。

    BS223S電子分析天平：賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；冰箱：美的公司；紫外一可見(jiàn)分光光度、1 mL比色杯：尤尼科（上海）儀器有限公司。

1.2溶液配制

1.2.1磷酸鹽緩沖溶液

    將13.8 g磷酸二氫鈉加水溶解并定容至0.1 L，得1 mol/L的Na2HPO4溶液；將14.2 g磷酸氫二鈉加水溶解并定容至0.1 L，得1 mol/L Na2HPO4溶液。將13.8 mL的1 mol/L的磷酸氫二鈉與87.7 mL的1 moI/L的磷酸二氫鈉溶液混合，加水定容至1L制得磷酸鹽緩沖液。

1.2.2 EDTA配置

    將1 040 uL濃度為0.5 mol/L的EDTA溶于14 000uL的水中，配得34.4 mmol/L的EDTA溶液。

1.2.3  NADH配置

    稱(chēng)取0.106 g NADH粉末加水定容至100 mL配得濃度為1.5 mmol/L的NAHD溶液。

1.2.4雙乙酰輔酶A配置

    將8 mg的雙乙酰輔酶A(Acetoacetyl-CoA)溶于1600 uL水中，配得5.9 mmol/L雙乙酰輔酶A溶液。1.3試驗(yàn)原理

    B-羥基輔酶A脫氫酶（HADH酶）是一種廣泛存在于動(dòng)物細(xì)胞中的線粒體酶。在冷凍過(guò)程中，蝦肉組織里的自由水凍結(jié)形成小冰晶，解凍過(guò)程中，小冰晶聚集成大冰晶，使細(xì)胞遭到破壞，HADH酶隨之釋放出來(lái)，因此解凍肉的HADH酶活理論上高于新鮮肉，通過(guò)測(cè)定HADH酶活可以區(qū)分解凍肉與新鮮肉。在室溫( 25 0C)、pH 6的條件下,B-羥基輔酶A脫氫酶( HADH)在雙乙酰輔酶A(Acetoacetyl-CoA)的協(xié)同作用下，使底物煙酰胺腺嘌呤二核苷酸( NADH) 脫氫生成NAD+。

    其反應(yīng)過(guò)程為：

                       HADH

  Acetoacetyl-CoA+NADH+H+->B-hydroxyacyl-CoA+NAD+

    HADH酶作為催化劑作用于NADH脫氫過(guò)程，HADH酶活力決定了反應(yīng)速度。反過(guò)來(lái)，通過(guò)觀察反應(yīng)速度可判斷HAHD酶活，該試驗(yàn)就是通過(guò)檢測(cè)反應(yīng)速度來(lái)推算樣本提取液中的HADH酶活。而反應(yīng)速度可通過(guò)NADH（反應(yīng)物）的減少速率或NAD+（生成物）的增加速率判斷，反應(yīng)物NADH在340 nm處有最大吸光度，因此HADH酶活高低可通過(guò)NADH在340

 nm處吸光度的下降速率判斷。

1.4試驗(yàn)方法

    試驗(yàn)方法為：向樣品中加入10 mL濃度為0.1 mol/L磷酸鹽緩沖鹽溶液(pH 6)，使樣品充分浸潤(rùn)，靜置15 min后用0.22 um水膜過(guò)濾，取15uL 濾液加入600uL 磷酸鹽緩沖液中，向該體系中加入47 uL的濃度為34.4 mmol/L EDTA溶液，反應(yīng)3min后加入27uLNADH( 1.5 mmol/L)和10uL的濃度為5.9 mmol/L Acetoacetyl-CoA，混合均勻后立即在340 nm處測(cè)定吸光度A0，每隔10 s讀取一次吸光度，記錄前250 s的吸光度。該試驗(yàn)在常溫下進(jìn)行。

    用所測(cè)定的吸光度( ABS)為縱坐標(biāo)，測(cè)定時(shí)間( min)為橫坐標(biāo)作圖，得到斜率(Slope)，HADH酶活值用公式(1)計(jì)算：

    HADH=- 104×Slope    (1)

1.5試驗(yàn)內(nèi)容

1.5.1  新鮮對(duì)蝦（或蝦姑）與解凍對(duì)蝦（或蝦姑）HADH酶活值分析

    取新鮮的30只對(duì)蝦和30只蝦姑進(jìn)行放于4 0C保藏3h后進(jìn)行HADH酶活測(cè)定，取另外新鮮的30只對(duì)蝦和30只蝦姑放于-18℃冷凍12 h，之后放于40C保藏3h進(jìn)行HADH酶活測(cè)定。分析時(shí)去掉外殼，去掉頭等部位，只留蝦仁。分別測(cè)定新鮮對(duì)蝦（或蝦姑）與解凍對(duì)蝦（或蝦姑）的HADH酶活值，每組3只，共10組。

1.5.2判別分析方法的建立

    將新鮮對(duì)蝦（或蝦姑）與解凍對(duì)蝦（或蝦姑）的HADH酶活值分析結(jié)果置入SPSS19.0，通過(guò)對(duì)比其酶活，建立判別分析方法。然后根據(jù)顯著性分析結(jié)果確定新鮮對(duì)蝦（或蝦姑）與解凍對(duì)蝦（或蝦姑）的HADH酶活判別閾值。

1.5.3新酶活閾值的檢驗(yàn)

    各取10組經(jīng)加密后的對(duì)蝦和蝦姑作為檢測(cè)對(duì)象分析新的酶活閾值是否準(zhǔn)確，每組共3個(gè)樣品。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    判別分析采用Fisher判別分析法，步進(jìn)方式進(jìn)行歸類(lèi)，差異性顯著性分析用SPSS 19.0( IBM)分析，顯著性分析假設(shè)齊方差，判斷方法為Duncan多重比較法或Levene比較法。將95%的置信區(qū)間加減0.5倍標(biāo)準(zhǔn)偏差作為新的判別閾值，并根據(jù)新的HADH酶活閾值判別經(jīng)加密的樣品確定該方法的準(zhǔn)確性。

2結(jié)果與分析

2.1新鮮對(duì)蝦（或蝦姑）與解凍對(duì)蝦（或蝦姑）HADH酶活值差異分析結(jié)果

2.1.1  新鮮對(duì)蝦與解凍對(duì)蝦HADH酶活值差異分析結(jié)果

    分別將新鮮對(duì)蝦和解凍對(duì)蝦按照方法1.4進(jìn)行HADH酶活值測(cè)定，如表1所示。

    通過(guò)對(duì)表1觀察得知，新鮮對(duì)蝦HADH酶活均值為56，標(biāo)準(zhǔn)偏差為28，95%置信區(qū)間為44～85，樣品中HADH酶活值最低為24，最高酶活值為102；解凍對(duì)蝦HADH酶活均值為1 1 1，標(biāo)準(zhǔn)偏差為37，95%置信區(qū)間為84~138，樣品中HADH酶活值最低為67，最高為163。新鮮對(duì)蝦與解凍對(duì)蝦HADH酶活值具有顯著性差異。

2.1.2新鮮蝦姑與解凍蝦姑HADH酶活值差異分析結(jié)果

    將新鮮蝦姑和解凍蝦姑分為兩組，按照方法1.4分析其HADH酶活值，結(jié)果如表2所示。

    表2結(jié)果顯示，新鮮蝦姑HADH酶活均值為49，標(biāo)準(zhǔn)偏差為19，95%置信區(qū)間為35～63，樣品中HADH酶活值最低為23，最高酶活值為76；解凍蝦姑HADH酶活均值為295，標(biāo)準(zhǔn)偏差為59，95%置信區(qū)間為253，均值337，樣品中HADH酶活值最低為225，最高為387。表2統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果說(shuō)明，新鮮蝦姑與解凍蝦姑具有極顯著差異，p <0.001。該結(jié)果與前人研究結(jié)果類(lèi)似，發(fā)現(xiàn)新鮮對(duì)蝦HADH酶活值為10.8，解凍對(duì)蝦HADH酶活值為75，兩組結(jié)果具有極顯著差異，新鮮牛蛙后腿與解凍牛蛙后腿HADH酶活值有極顯著性差異。

2.2  新鮮對(duì)蝦（或蝦姑）與解凍對(duì)蝦（或蝦姑）HADH酶活值判別分析結(jié)果

2.2.1  新鮮對(duì)蝦與解凍對(duì)蝦HADH酶活值判別分析結(jié)果

    為快速判別冷鮮對(duì)蝦樣品是否經(jīng)過(guò)冷凍，建立區(qū)分新鮮對(duì)蝦與解凍對(duì)蝦的判別分析方法，采用Fisher函數(shù)和組內(nèi)相關(guān)矩陣分析發(fā)現(xiàn)，雖然新鮮對(duì)蝦與解凍對(duì)蝦HADH酶活值具有顯著性差異，但新鮮對(duì)蝦有3組HADH酶活值高于新鮮樣品與解凍樣品閾值，解凍對(duì)蝦有4組HADH酶活值低于新鮮樣品與解凍樣品閾值。結(jié)果如表3所示。

    為方便判別，將新鮮對(duì)蝦與解凍對(duì)蝦得到的數(shù)據(jù)分布看成正態(tài)分布，然后重新確定新鮮對(duì)蝦與解凍對(duì)蝦的HADH酶活閾值。將判別結(jié)果結(jié)合顯著性結(jié)果，新鮮對(duì)蝦HADH酶活值95%置信區(qū)間為44~85，將上限85減0.5倍的標(biāo)準(zhǔn)偏差值為71，根據(jù)正態(tài)分布曲線，從負(fù)無(wú)窮積分至71涵蓋總數(shù)據(jù)量的60%以上；解凍對(duì)蝦HADH酶活值95%置信區(qū)間為84～138，將下限84加0.5倍的標(biāo)準(zhǔn)偏差為102，根據(jù)正態(tài)分布曲線，從102積分至正無(wú)窮涵蓋解凍對(duì)蝦HADH酶活值總數(shù)據(jù)量的60%以上。根據(jù)正態(tài)分布結(jié)果，重新建立根據(jù)HADH酶活值判斷新鮮對(duì)蝦與解凍對(duì)蝦來(lái)源的閾值，即當(dāng)未知樣品的HADH酶活值小于71時(shí)，該來(lái)源的樣品為新鮮對(duì)蝦，當(dāng)HADH酶活值大于102時(shí)，該來(lái)源的樣品為解凍對(duì)蝦，當(dāng)HADH酶活值介于71～102之間時(shí)，需重新判斷樣品的來(lái)源。

2.2.2新鮮蝦姑與解凍蝦姑HADH酶活值判別分析結(jié)果

    根據(jù)表2結(jié)果顯示，新鮮蝦姑HADH酶活最高值為76，解凍蝦姑HADH酶活最低為225。新鮮蝦姑與解凍蝦姑判別分析如表4所示。

    根據(jù)表4得知，所有的樣品均得到正確的分類(lèi)，結(jié)合正態(tài)曲線分布結(jié)果，可簡(jiǎn)單根據(jù)新鮮蝦姑與解凍蝦姑HADH酶活值進(jìn)行判斷，即當(dāng)蝦姑HADH酶活值低于76為新鮮蝦姑，當(dāng)蝦姑HADH酶活值高于225為解凍蝦姑，當(dāng)HADH酶活值介于76和225之間時(shí)，需重新

判斷。

2.3新鮮對(duì)蝦（或蝦姑）與解凍對(duì)蝦（或蝦姑）再測(cè)樣本分析

    將得到的新閾值再次判斷經(jīng)加密的10組樣品，每組3個(gè)樣品，將結(jié)果代人新的判別閾值如表5所示。表5結(jié)果顯示，該判斷結(jié)果準(zhǔn)確率100%，其中有1組對(duì)蝦HADH酶活均值介于71～102之間，有1組蝦姑HADH酶活均值介于76和225之間，需重新判斷（對(duì)蝦和蝦姑均相同，見(jiàn)表5）。

3結(jié)論

以對(duì)蝦和蝦姑為研究對(duì)象，建立根據(jù)HADH酶法區(qū)分新鮮對(duì)蝦與解凍對(duì)蝦、新鮮蝦姑與解凍蝦姑的方法，并根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果可快速判別未知樣品是否經(jīng)過(guò)冷凍。當(dāng)對(duì)蝦樣品HADH酶活值小于71時(shí)為新鮮樣品，大于102時(shí)為解凍樣品，介于兩者之間時(shí)需重新判斷；當(dāng)蝦姑HADH酶活值低于76為新鮮樣品，大于225為解凍樣品，介于兩者之間時(shí)需重新判斷。試驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確度高達(dá)100%，且設(shè)備簡(jiǎn)單、試驗(yàn)操作簡(jiǎn)便，為判斷新鮮對(duì)蝦與解凍對(duì)蝦、新鮮蝦姑與解凍蝦姑提供參考，為進(jìn)一步的深入研究提供理論依據(jù)。

4摘要

為快速區(qū)分新鮮對(duì)蝦（或蝦姑）與解凍對(duì)蝦（或蝦姑），以放置在4℃的新鮮對(duì)蝦與新鮮蝦姑以及放置-18℃經(jīng)4℃解凍的解凍對(duì)蝦與解凍蝦姑為原料，建立根據(jù)HADH酶法快速區(qū)分新鮮樣品與解凍樣品的方法，并根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果分類(lèi)未知樣品。研究結(jié)果顯示，新鮮對(duì)蝦與解凍對(duì)蝦HADH酶活均值分別為65和111，新鮮蝦姑與解凍蝦姑HADH酶活均值分別為49和295，且新鮮對(duì)蝦（或新鮮蝦姑）與解凍對(duì)蝦（或解凍蝦姑）HADH酶活具有顯著性差異，新鮮蝦姑與解凍蝦姑HADH酶活值具有顯著性差異。顯著性結(jié)果結(jié)合判別結(jié)果顯示，當(dāng)對(duì)蝦樣品HADH酶活值小于71時(shí)為新鮮樣品，大于102時(shí)為解凍樣品，介于兩者之間時(shí)需重新判斷；當(dāng)蝦姑樣品HADH酶活值低于76為新鮮樣品，大于225為解凍樣品，介于兩者之間時(shí)需重新判斷。該方法的準(zhǔn)確率高達(dá)100%，該研究結(jié)果為判斷新鮮海產(chǎn)品與解凍海產(chǎn)品提供直接參照。