關(guān)于利用CRISPR/Cas9n系統(tǒng)敲除人源SNF5基因的研究
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作者：張毅
CRISPR/Cas9系統(tǒng)是基于細(xì)菌和古細(xì)菌的這種免疫防御機(jī)制而改造的一種基因組編輯技術(shù)，利用人工設(shè)計(jì)的單向?qū)NA(single-guide RNA，sgRNA)介導(dǎo)外源Cas9蛋白與靶基因結(jié)合，切割帶有5，-NGC的問隔相鄰基序(protospacer adjacent motifs，PAM)，從而實(shí)現(xiàn)對靶基因DNA的特異性切割。
表觀遺傳在癌癥發(fā)生發(fā)展中有重要作用，染色質(zhì)重塑是表觀遺傳的重要機(jī)制之一，染色質(zhì)重塑復(fù)合物通過水解ATP產(chǎn)生的能量來改變?nèi)旧|(zhì)結(jié)構(gòu)，進(jìn)而調(diào)節(jié)基因表達(dá)。染色質(zhì)重塑復(fù)合物是較大的多亞基復(fù)合物，已知有SWI/SNF、ISWI、CHD和IN080四大類。其中SWI/SNF是目前研究最多的，SNF5是SWI/SNF染色質(zhì)重塑復(fù)合物的核心組分之一，高度保守。研究發(fā)現(xiàn)SNF5是一個強(qiáng)抑癌基因，在許多惡性腫瘤中突變或缺失，如橫紋肌樣瘤、神經(jīng)鞘瘤、淋巴瘤、乳腺癌、上皮樣肉瘤及其他軟組織的惡性腫瘤等。目前有關(guān)SNF5的抗腫瘤機(jī)制研究不多。我們設(shè)計(jì)了針對SNF5基因的sgRNA，構(gòu)建了SNF5基因的CRISPR/Cas9n表達(dá)載體，旨在通過敲除SNF5基因?yàn)樯钊胙芯縎NF5的抗腫瘤機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
1 材料與方法
1.1材料
人胚腎293T細(xì)胞、大腸桿菌DH5a、pX461和pX462質(zhì)粒（本研究室保存）；Bbs I、磷酸酯酶(Fer-mentas公司)；T。DNA連接酶、T4多聚核苷酸激酶（NEB公司）；膠回收試劑盒、無內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒（天根生化科技有限公司）；DMEM高糖培養(yǎng)基（Gibco公司）；胎牛血清（PAN公司）；Lipo-fec:tAMINE 2000（Invitrogen公司）；抗SNF5抗體（Abcam公司）；3-actin抗體、辣根過氧化物酶偶聯(lián)的羊抗鼠IgG（Santa Cruz公司）。
1.2 sgRNA靶點(diǎn)選擇及其寡核苷酸鏈設(shè)計(jì)
應(yīng)用CRISPR在線設(shè)計(jì)工具(http://crispr.mit.edu/)，在人源.SNF5基因外顯子1處設(shè)計(jì)了一對sgRNA。設(shè)計(jì)過程如下：①從SNF5基因起始密碼子處開始尋找長度約200 bp、富含NGG且位于同一外顯子上的序列，將序列提交至該網(wǎng)站；②根據(jù)提交后網(wǎng)站顯示的結(jié)果，選擇分?jǐn)?shù)較高的一對序列，自動生成的靶序列都是5 '到3'共23 bp;③去掉序列3'端的NGG，并在5'端加上酶切位點(diǎn)CACC，其反向互補(bǔ)序列的5'端添加酶切位點(diǎn)AAAC，以便2條互補(bǔ)的寡核苷酸序列退火后，能夠與經(jīng)Bbs I酶切的質(zhì)粒的粘性末端互補(bǔ)；如果靶序列5'端第一個堿基不是G，那么應(yīng)先在5'端添加一個C，再加上酶切位點(diǎn)CACC，相應(yīng)地其反向互補(bǔ)序列的3'端再增加一個C。
1.3 SNF5sgRNA表達(dá)載體的構(gòu)建
首先用T4多聚核苷酸激酶對合成的2組引物分別進(jìn)行磷酸化和退火，退火后的sgRNA分別插入經(jīng)BbsI酶切的表達(dá)載體pSpCas9n(BB) -2A-CFP（簡稱pX461）和pSpCas9n( BB) -2A-Puro（簡稱pX462）中，然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞，挑取單克隆菌落進(jìn)行測序鑒定（南北京六合華大基因科技股份有限公司完成），測序引物為5'一ATACGATACAAGGCTGTTAGAGAGATA-3'。
1.4細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染
用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)293T細(xì)胞，將處于對數(shù)期生長的細(xì)胞接種于12孔板，接種量以轉(zhuǎn)染時細(xì)胞密度達(dá)到90%為宜，培養(yǎng)24 h后進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染過程按照LipofectAMINE 2000的說明書進(jìn)行。
1.5 Westen印跡分析
轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后24-48 h收集細(xì)胞，加入SDS上樣緩沖液，煮沸10 min，離心后取上清液進(jìn)行SDS-PAGE；電泳完畢轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，然后加入用5%脫脂奶粉稀釋的SNF5抗體，4℃過夜，TBST洗膜3次，每次7mln;加入用5%脫脂奶粉稀釋的辣根過氧化物酶偶聯(lián)的羊抗鼠IgG，室溫輕搖1 h，TBST洗膜3次，每次7 min；顯色后壓片顯影。
2結(jié)果
2.1 sgRNA靶點(diǎn)及寡核苷酸序列設(shè)計(jì)
將選擇的人源SNF5基因序列在線提交上述網(wǎng)站后，在外顯子1處設(shè)計(jì)了一對sgRNA（圖1），網(wǎng)站生成的序列為s-- GACCGCGACrTCTACATGATCGG-3'和5'- CTTCACC(JCCTTCTGCCCGAAGG-3'.根據(jù)生成的靶序列，設(shè)計(jì)了4條寡核苷酸序列(表1)。將合成的2組寡核苷酸序列分別退火，退火后插入經(jīng)Bbs I酶切的表達(dá)載體pX461和pX462，構(gòu)建的表達(dá)載體分別為pX461-hSNF5sgRNAl .pX461-hSNF5sgRNA2，pX462- hSNF5sgRNAI和pX462-hSNF5sgRNA2。
2.2 SNF5sgRNA表達(dá)載體構(gòu)建的測序結(jié)果
將構(gòu)建的4個表達(dá)載體分別測序，結(jié)果顯示sgRNA靶序列均正確插入pX461和pX462，證明SNF5sgRNA表達(dá)載體構(gòu)建成功（圖2）。
2.3 sgRNA對SNF5表達(dá)的影響
將pX461、pX461- hSNF5sgRNAl和pX461-hSNF5sgRNA2、pX462、pX462- hSNF5sgRNA1 和pX462-hSNF5sgRNA2分別轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后24、48 h收集細(xì)胞裂解液進(jìn)行Western印跡。結(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)染pX461空載體組比，轉(zhuǎn)染pX461-hSNF5sgRNA1和pX461- hSNF5sgRNA2后24 h,SNF5表達(dá)水平明顯降低，轉(zhuǎn)染后48 h，SNF5表達(dá)水平開始恢復(fù)；與轉(zhuǎn)染pX462空載體組比，轉(zhuǎn)染pX462- hSNF5sgRNA l和pX462- hSNF5sgRNA2后24 h，SNF5表達(dá)水平?jīng)]有明顯改變，轉(zhuǎn)染后48 h，SNF5表達(dá)水平顯著降低（圖3）。此現(xiàn)象表明，不同標(biāo)簽載體表達(dá)的sgRNA起效時問并不一致，需要根據(jù)實(shí)驗(yàn)的具體情況進(jìn)行摸索。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，我們構(gòu)建的針對人源SNF5基因的CRISPR/Cas9n系統(tǒng)能夠敲除細(xì)胞中SNF5基因的表達(dá)。
3討論
Cas9核酸內(nèi)切酶有HNH和RuvC兩個活性位點(diǎn)，切割后產(chǎn)生雙鏈DNA斷裂�；蚪MDNA通過啟動同源重組和非同源末端連接機(jī)制進(jìn)行修復(fù)，可能產(chǎn)生基因突變、插入或缺失。CRISPR/Cas9的特異性與跟sgRNA配對且靠近PAM處的7-12個堿基有關(guān)，因此CRISPR/Cas9的靶向特異性非常低，會造成研究結(jié)果的不確定性及工作量的大量增加，這種脫靶效應(yīng)會導(dǎo)致基因組中癌基因激活、其他序列突變等不良后果，給臨床應(yīng)用帶來風(fēng)險。張峰課題組將Cas9的RuvC催化位點(diǎn)進(jìn)行突變，形成產(chǎn)生單鏈切口的核酸酶Cas9 nickase (Cas9n)，通過一對sgRNA引導(dǎo)來實(shí)現(xiàn)靶向雙鏈切割，此方法能顯著降低（約1/50-1/1500）CRISPR/Cas9系統(tǒng)在細(xì)胞系中的脫靶效應(yīng)。
本研究采用的即為上述CRJSPR-Cas9n系統(tǒng)，本系統(tǒng)所用質(zhì)粒是CRISPR與Cas9n的共質(zhì)粒表達(dá)系統(tǒng)，可以提高基因敲除效率。在設(shè)計(jì)sgRNA靶序列時應(yīng)注意：靶序列應(yīng)位于基因同一個外顯子內(nèi)，不能在外顯子與內(nèi)含子交界處，日一靶序列應(yīng)位于基因的CDS區(qū)；如果外顯子內(nèi)CDS序列少于60 bp，則沒必要再進(jìn)行設(shè)計(jì)，即使設(shè)計(jì)了效果也不佳；選擇的靶序列離ATG越近越好。在線提交所選基因序列后，得出的評分結(jié)果是針對脫靶效應(yīng)的，分值越高脫靶效應(yīng)越小。
我們發(fā)現(xiàn)，293T細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)入SNF5sgRNA后，與轉(zhuǎn)染空載體組比，SNF5表達(dá)水平顯著降低。這種SNF5表達(dá)水平改變反映的是SNF5在細(xì)胞群體水平敲除后的變化，CRISPR/Cas9系統(tǒng)切割基因組DNA后，細(xì)胞會啟動同源重組和非同源末端連接機(jī)制進(jìn)行修復(fù)，這些修復(fù)是隨機(jī)的，不同細(xì)胞個體突變修復(fù)后的基因型各不相同。本實(shí)驗(yàn)中我們選擇了表達(dá)綠色熒光蛋白的pX461和表達(dá)嘌呤霉素的pX462兩種載體，可以借助綠色熒光蛋白進(jìn)行流式分選或借助嘌呤霉素進(jìn)行抗性篩選，實(shí)現(xiàn)目的細(xì)胞的聚集，便于通過有限稀釋法獲取SNF5基因穩(wěn)定敲除的單克隆細(xì)胞，通過測序即可得到基因型確定的敲除細(xì)胞株。
研究發(fā)現(xiàn)，SNF5基因的缺失是非典型畸胎瘤、橫紋肌樣瘤、黑色素瘤患者診斷的一個很好的標(biāo)記物。Roberts等發(fā)現(xiàn)，SNF5條件性失活小鼠在平均11周內(nèi)發(fā)生T細(xì)胞淋巴瘤，明顯快于p53、RB等重要腫瘤抑制基因。然而SNF5突變后如何導(dǎo)致染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變，如何影響基因的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而如何導(dǎo)致癌癥的具體機(jī)制在很大程度上仍然不清楚。
綜上，我們利用CRISPR/Cas9技術(shù)建立了SNF5基因靶向敲除系統(tǒng)，通過敲除細(xì)胞株中SNF5基因，為研究其在疾病中的功能和具體作用機(jī)制提供了很好的工具。
4[摘要] 目的：建立敲除人源基因組中SNF5基因的CRISPR/Cas9n系統(tǒng)。方法：設(shè)計(jì)一對靶向人源SNF5基因第1個外顯子的sgRNA，分別克隆至pX46l.pX462表達(dá)載體后，轉(zhuǎn)入人胚腎293'細(xì)胞，通過We ste rn印還檢測細(xì)胞株中SNF5基因的敲除效果。結(jié)果：測序證明構(gòu)建的靶向SNF5基因CRISPR/Cas9n重組質(zhì)粒與設(shè)計(jì)吻合．Weslern印跡結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒pX461-hSNF5sgRNA轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后24 h，細(xì)胞內(nèi)SNF'5表達(dá)水平明顯降低；重組質(zhì)粒pX462-hSNF5sgRNA轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后48 h，細(xì)胞內(nèi)SNF5表達(dá)水平顯著降低。結(jié)論：通過CRISPR/Cas9n系統(tǒng)獲得了靶向SNF5基因的重組質(zhì)粒，構(gòu)建的重組質(zhì)粒能有效敲除SNF5基因的表達(dá)。
