深港兩地工程土壤細(xì)菌多樣性的T-RFLP分析
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龍海，章桂明，馮建軍，李芳榮，程穎慧，焦懿，王穎，李一農(nóng)
1．深圳出入境檢驗(yàn)檢疫局，廣東深圳518001；
2．深圳市檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院深圳市外來有害生物檢測技術(shù)研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東深圳518045
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[摘要]目的：建立一種高效的末端限制性片段長度多態(tài)性(T-RFLP)方法，檢測工程土壤細(xì)菌。方法：以深圳和香港兩地不同土層（0.5，10，20和30 m）的工程土壤為研究對(duì)象，提取并純化總DNA，利用細(xì)菌16S rDNA基因通用引物8f-FAM/1492r進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物分別用Hha I、Hae,Ⅲ和M.sp I限制性內(nèi)切酶酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)毛細(xì)管電泳測序，序列上傳至數(shù)據(jù)庫進(jìn)行分析。結(jié)果：經(jīng)過比對(duì)分析，香港段土壤中大約存在細(xì)菌141屬，235種；深圳段大約存在132屬，206種；32個(gè)細(xì)菌種屬只在香港土壤中有分布，3個(gè)細(xì)菌種屬只在深圳土壤中有分布；植物病原細(xì)菌有14個(gè)種屬。結(jié)論：建立的T-RFLP方法能夠高效、快速地分析工程土壤細(xì)菌。
[關(guān)鍵詞]工程土壤；細(xì)菌多樣性；末端限制性片段長度多態(tài)性
隨著深圳和香港經(jīng)貿(mào)往來日益頻繁，國家“一帶一路”戰(zhàn)略的穩(wěn)步推進(jìn)，包括深港兩地在內(nèi)的各種跨境工程項(xiàng)目也在積極籌備或?qū)嵤┊?dāng)中，一些境外的工程土壤可能會(huì)入境，勢必會(huì)涉及到工程土壤的檢疫問題。而我國還沒有應(yīng)對(duì)的檢疫標(biāo)準(zhǔn)和方法，因此有必要進(jìn)行一些探索和嘗試。
土壤中的微生物種類超過100萬種，其中主要是細(xì)菌、放線菌和真菌。土壤中的微生物對(duì)自然界物質(zhì)的轉(zhuǎn)化和循環(huán)起著極為重要的作用，對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和環(huán)境保護(hù)有著不可忽視的影響，尤其是一些檢疫性有害微生物可能會(huì)影響農(nóng)作物的安全生產(chǎn)。研究發(fā)現(xiàn)土壤中高達(dá)990/0的微生物尚未被培養(yǎng)，其功能尚不可知。
末端限制性片段長度多態(tài)性(terminal restric-tion fragment length polymorphism,T-RFLP)技術(shù)是研究微生物多樣性的一種分子生物學(xué)方法，不依賴培養(yǎng)就可以對(duì)樣品中的微生物群落進(jìn)行分析。我們以深港兩地不同土層的T程土壤為研究對(duì)象，利用T-RFLP技術(shù)分析土壤細(xì)菌的多樣性，并進(jìn)行比較研究，為工程土壤的檢疫提供技術(shù)支持，為后續(xù)的風(fēng)險(xiǎn)分析和土壤檢疫處理提供科學(xué)依據(jù)。
1 材料和方法
1.1供試土樣
供試土壤樣品見表1。其中香港3個(gè)取樣點(diǎn)、深圳2個(gè)取樣點(diǎn)，每個(gè)取樣點(diǎn)分別在0.5、10、20和30m土層處各取1份樣品，每份樣品3～5 kg，裝入封口袋，放入土壤采集專用保藏箱(4C)，并應(yīng)盡可能在原有狀態(tài)下迅速送回實(shí)驗(yàn)室，-20℃保存。
1.2 總DNA的提取和純化
本研究中土壤樣品總DNA提取采用E．Z．N．A．Mag-Bind Soil DNA Kit提取試劑盒，具體提取步驟參見試劑盒說明書。
1.3 T-RFLP分析
1.3.1 土壤細(xì)菌16S rDNA擴(kuò)增 用于擴(kuò)增細(xì)菌16S rDNA的引物是FAM熒光標(biāo)記的細(xì)菌通用引物8f- FAM(5,- AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 7)和1492r(5 7一ACGGTTACCTTGTTACGACTT- 3')。反應(yīng)體系包括25 pdL Maxima Hot start PCR MasterMix (2x)、8f- FAM和1492r（均為10 ymol/L）各2uL、DNA模板4 uL，加ddH：0至50 uL 。PCR反應(yīng)條件：95℃變性5 min；95℃變性45 s，52cC退火45s，72。C延伸2 min，35個(gè)循環(huán)；72CC延伸10 min。取5 uL擴(kuò)增產(chǎn)物，經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。PCR產(chǎn)物用E.Z.N.A. Cycle-Pure Kit純化回收試劑盒純化，按照說明書方法進(jìn)行。
1.3.2 PCR產(chǎn)物的限制性酶切純化后的PCR產(chǎn)物分別用限制性內(nèi)切酶FastDigest Hha I、HaeⅢ和Msp I酶切，方法根據(jù)相應(yīng)內(nèi)切酶的使用說明。30 uL反應(yīng)體系包括2 111 FastDigest緩沖液、10 uL純化的PCR產(chǎn)物、1 uL內(nèi)切酶、17 uL ddH：0。反應(yīng)混合物在37C快速消化5～10 min后，酶切產(chǎn)物在4%瓊脂糖膠上電泳，同時(shí)送上�；瞪锛夹g(shù)有限公司進(jìn)行毛細(xì)管電泳測序分析。
1.3.3 T-RFLP數(shù)據(jù)處理 T-RFLP圖譜中，每一個(gè)末端限制性片段峰(terminal restriction fragment，TRF)以系統(tǒng)分類操作單元（operational taxonomicunit，OTU)表示，至少代表1種類型的微生物。將T-RFLP分析掃描結(jié)果用Peak Scanner軟件(v1.0)輸出，結(jié)果上傳到MICA網(wǎng)站(http://mica.ibest．uidaho．edu/pat．php)進(jìn)行在線比對(duì)，確定細(xì)菌種類。
2結(jié)果
2.1 土壤DNA的提取
采用試劑盒對(duì)從土壤中提取的宏基因組DNA進(jìn)行后續(xù)種群多樣性分析。由于土壤總DNA代表了土壤中整個(gè)細(xì)菌區(qū)系的基因組成，所以提取質(zhì)量是后續(xù)分析的關(guān)鍵。對(duì)各供試土壤樣品進(jìn)行提取，所得到的宏基因組DNA經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳后，譜帶清晰（圖1），表明獲得的土壤微生物總DNA可用于后續(xù)分析。
2.2 16S rDNA擴(kuò)增
利用細(xì)菌16S rDNA基因通用正向引物8f-FAM和反向引物1492r對(duì)所有提取土壤總DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到16S rDNA產(chǎn)物，長度約為1500 bp(圖2)。為了減少PCR反應(yīng)中的隨機(jī)性偏差，每個(gè)模板進(jìn)行了5個(gè)平行的PCR反應(yīng)，將所有產(chǎn)物混合起來進(jìn)行下一步研究。
2.3 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的酶切
利用3種限制性內(nèi)切酶Hha I、HaeⅢ和MspI對(duì)純化的細(xì)菌16S rDNA的PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切，酶切圖譜見圖3。由于酶切位點(diǎn)不同，3種酶對(duì)同一種樣品的酶切結(jié)果存在明顯差異。
2.4 T-RFLP分析
酶切產(chǎn)物經(jīng)毛細(xì)管電泳檢測，得到一系列TRF圖譜。用Peak Scanner軟件分析所有樣品所包含的TRF數(shù)目及分子大小，分析時(shí)選擇size standard范圍為500—250 liz,analysis method為sizing default_npp進(jìn)行。部分土壤樣品的T-RFLP圖譜見圖4，其中縱坐標(biāo)是DNA片段的信號(hào)強(qiáng)度，橫坐標(biāo)代表了DNA片段在毛細(xì)管中電泳至榆測孔的時(shí)間，經(jīng)過軟件計(jì)算后對(duì)應(yīng)其相對(duì)分子質(zhì)量大小�？梢钥闯�，不同土壤樣品的TRF存在明顯差異，代表樣品中的細(xì)菌群落也存在明顯差異。
2.5 細(xì)菌種類比較
經(jīng)過MICA網(wǎng)站在線檢索，把HaeⅢ的酶切片段與來自同一樣品的Msp I和Hha I酶切片段匹配后得到對(duì)應(yīng)的微生物。香港段土壤中大約存在細(xì)菌141屬，235種；深圳段大約存在132屬，206種；其中香港段存在而深圳段沒有的細(xì)菌32種，深圳段有而香港段沒有的細(xì)菌3種；植物細(xì)菌為14種（表2）。香港段土壤中，0.5 m處微生物約51屬104種，10 m處約74屬1 1 1種，20 m處約73屬98種，30 m處約49屬71種；深圳段土壤中，0.5 m處微生物約62屬93種，10 m處約71屬95種，20 m處約69屬92種，30 m處約33屬41種（圖5）。
3討論
自然界中僅有不到l%的微生物能夠進(jìn)行人工培養(yǎng)，因此僅依賴于微生物培養(yǎng)技術(shù)不能全面反映所在環(huán)境的微生物多樣性。同時(shí)，微生物分離培養(yǎng)過程會(huì)改變或偏離原來的小環(huán)境，很有可能影響部分微生物原來的種群結(jié)構(gòu)。此外，通過平板菌落培養(yǎng)后，微生物有機(jī)體還有可能會(huì)偏離原來自然種群的生理習(xí)性，甚至原有的基因型組合。
因此，我們利用T-RFLP技術(shù)對(duì)深港兩地不同土層的工程土壤中的細(xì)菌種類進(jìn)行了分析。該技術(shù)不用平板培養(yǎng)即可進(jìn)行細(xì)菌菌株鑒定和群落比較分析，相對(duì)于其他研究技術(shù)具有以下優(yōu)點(diǎn)：①高通量，能夠迅速產(chǎn)生大量可重復(fù)的數(shù)據(jù)；②能夠直接從數(shù)據(jù)庫中獲得參照信息用于標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)計(jì)分析，可以實(shí)現(xiàn)數(shù)字化；③酶切產(chǎn)物采用毛細(xì)管凝膠電泳分析，靈敏度高，可靠性大。T-RFLP已廣泛應(yīng)用于土壤、腸道、受污染環(huán)境及污染物處理工藝等環(huán)境中微生物種群結(jié)構(gòu)差異的分析等研究。雖然該技術(shù)的圖譜無法進(jìn)行雜交或直接克隆測序分析，而且單酶切的TRF片段在數(shù)據(jù)庫中匹配不夠精確，無法鑒定至種甚至屬水平，但可以采用不同的內(nèi)切酶對(duì)同一樣品分別進(jìn)行消化，通過疊加靶基因酶切位點(diǎn)，使待鑒定種屬在數(shù)據(jù)庫中的匹配度提高。本研究中，我們使用了3種限制性內(nèi)切酶，由于數(shù)據(jù)庫尤其是除了rRNA基因之外的其他功能基因庫的不完善，某些出現(xiàn)在TRFLP中的TRF可能找不到匹配對(duì)象�？梢栽诋a(chǎn)生TRFLP圖譜的同時(shí)，建立分析樣品的16S rRNA基因克隆文庫并測序鑒定，二者互補(bǔ)可解決上述問題。
