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　作者單位：276003山東省臨沂，臨沂市人民醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科（張建國(guó)、陳曉娟）;南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科（丁成志、邵強(qiáng)、曾振國(guó)、劉芬、錢(qián)克儉）
　　通信作者：錢(qián)克儉，Email：qkj0607@sohu.com
　　microRNA是一類(lèi)大小約22個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的內(nèi)源性非編碼小分子RNA^[1]，主要通過(guò)識(shí)別并結(jié)合靶基因 mRNA 的3’端非編碼區(qū)，在轉(zhuǎn)錄后水平抑制蛋白的翻譯或促進(jìn)靶基因的降解^[2-3]。有研究發(fā)現(xiàn)微小RNA參與肺內(nèi)炎癥反應(yīng)的調(diào)控^[4]，miR-146a是其中較有代表性的一個(gè)。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，用LPS刺激肺泡巨噬細(xì)胞，miR-146a的表達(dá)水平升高，并且升高程度與TNF-α mRNA呈負(fù)相關(guān)^[5];轉(zhuǎn)染miR-146a能下調(diào)LPS誘導(dǎo)肺泡巨噬細(xì)胞TNF-α的表達(dá)^[6]，表明miR-146a能抑制LPS誘導(dǎo)肺泡巨噬細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)擬進(jìn)一步探討miR-146a調(diào)控肺泡巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)的機(jī)制，為體內(nèi)試驗(yàn)提供理論依據(jù)。
　　1 材料和方法
　　1.1 材料
　　大鼠肺泡巨噬細(xì)胞NR8383（上海中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)）;LPS（E.coli 0111：B4）;Pre-miRTM miR-146a前體、CyTM3標(biāo)記的Pre-miRTM陰性對(duì)照（美國(guó)ABI公司）;大鼠 TNF-α ELISA 檢測(cè)試劑盒（上海森雄科技實(shí)業(yè)有限公司） ; PrimeScript逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR熒光染料試劑Ⅱ（SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ）PCR 檢測(cè)試劑盒（大連寶生物工程有限公司）;抗IRAK-1 抗體，抗TRAF-6 抗體、抗NF-κB p65抗體（美國(guó)abcam公司）。
　　1.2實(shí)驗(yàn)分組及處理
　　將體外培養(yǎng)的 NR8383 細(xì)胞按每孔1.5×106個(gè)接種至6孔板，每孔2 mL，每組2個(gè)復(fù)孔。轉(zhuǎn)染組轉(zhuǎn)染50 nmol/L的Pre-miRTM miR-146a前體，對(duì)照組轉(zhuǎn)染50 nmol/L 的 CyTM3 標(biāo)記的 Pre-miRTM 陰性對(duì)照，搖勻后繼續(xù)培養(yǎng)24 h，隨后加入1 μg/mL 終質(zhì)量濃度的 LPS 處理細(xì)胞6 h，離心收集細(xì)胞和上清液，-80 ℃保存。
　　1.3檢測(cè)指標(biāo)及方法
　　1.3.1免疫熒光法觀(guān)察 NF-κB p65 核移位情況將細(xì)胞爬片放置于24孔板;甲醇丙酮固定細(xì)胞，0.5%TritonX-100 PBS 透化細(xì)胞;再放入含10%驢血清的 PBS 中4 ℃封閉;孵育一抗：用0.5%TritonX-100 PBS稀釋兔抗 NF-κB p65（1∶50），常溫下孵育4 h后漂洗;孵育二抗：用10%驢血清的 PBS 稀釋 Alexa Flour 488 驢抗兔綠色熒光標(biāo)記二抗（1∶200），室溫下孵育20 min后漂洗;用 Dapi 染核，滴加防熒光粹滅劑、固定封片，在Olympus IS71倒置熒光顯微鏡下拍照分析。
　　1.3.2ELISA 檢測(cè) TNF-α 蛋白含量收集細(xì)胞上清液，按照 ELISA 試劑盒操作說(shuō)明書(shū)步驟操作檢測(cè) TNF-α 蛋白含量。
　　1.3.3RT-qPCR 檢測(cè) IRAK-1、TRAF-6 及TNF-α mRNA 表達(dá)采用 TRIzol 法提取細(xì)胞內(nèi)總 RNA，通過(guò)紫外分光光度計(jì)測(cè)定總 RNA 濃度，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總 RNA 完整性及純度。按照 PrimeScript逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，所有操作均在冰上完成。10 μL 的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系：PrimeScript 緩沖液 2μL，PrimeScript 逆轉(zhuǎn)錄酶復(fù)合物 10.5 μL，多聚胸腺嘧啶引物 0.5 μL，隨機(jī)的6核苷酸引物 0.5 μL，總RNA 500 ng，加無(wú)核酶水至總體積10 μL。反應(yīng)條件：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。20 μL 的 PCR反應(yīng)體系包括：cDNA 2 μL，上游引物 0.8 μL，下游引物 0.8 μL，SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ 10 μL，ROX Reference Dye 0.4 μL，無(wú)核酶水6 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 30 min，40個(gè)擴(kuò)增循環(huán)（95 ℃ 5 s，57 ℃ 20 s，72 ℃ 27 s）。選取β-actin 作為內(nèi)參，檢測(cè)IRAK-1 mRNA、TRAF-6 mRNA及TNF-α mRNA的表達(dá)，相對(duì)表達(dá)量采用2-ΔΔCt計(jì)算。引物序列及長(zhǎng)度見(jiàn)表1。
　　1.3.4IRAK-1、TRAF-6、NF-κB p65 蛋白表達(dá)收集細(xì)胞，離心，棄上清，提取總蛋白或分別提取胞核蛋白、漿蛋白，用BCA法測(cè)定蛋白濃度。完成聚丙烯酰胺凝膠電泳（每孔加樣20 μL）、轉(zhuǎn)膜、封閉，孵育一抗，兔抗 IRAK-1（1∶2000）、兔抗 TRAF-6 （1∶1000）、兔抗 NF-κB p65（1∶500）和鼠抗 β-actin（1∶3000）/兔抗 Lamin B1（1∶1000），4 ℃孵育過(guò)夜，漂洗3次;孵育二抗，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG 、山羊抗鼠 IgG（1∶4000），37 ℃孵育1-2 h，漂洗3次，暗室內(nèi)曝光、顯影并定影，行X膠片掃描，通過(guò) Quantity One 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，檢測(cè) IRAK-1、TRAF-6及胞漿NF-κB p65蛋白以 β-actin 作為內(nèi)參，細(xì)胞核內(nèi)NF-κB p65蛋白以 Lamin B1作為內(nèi)參。
　1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
　　采用 SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩樣本比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　2結(jié)果
　　2.1過(guò)表達(dá) miR-146a 對(duì) LPS 誘導(dǎo)的 NR8383 細(xì)胞 NF-κB p65 核移位的影響
　　2.1.1免疫熒光法觀(guān)察細(xì)胞 NF-κB p65 核移位的變化倒置熒光顯微鏡下觀(guān)察到NF-κB p65 呈綠色熒光，Dapi 染核后呈藍(lán)色熒光。與對(duì)照組比較，觀(guān)察到轉(zhuǎn)染組 NF-κB p65 胞核中表達(dá)減少，胞漿中增多。見(jiàn)圖1。
　　2.2過(guò)表達(dá) miR-146a 對(duì) LPS 刺激的NR8383細(xì)胞 TNF-α表達(dá)的影響
　　 與對(duì)照組相比較，RT-qPCR 檢測(cè)NR8383細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-146a后TNF-α mRNA表達(dá)下調(diào)至（0.47±0.06）倍（P<0.05）;ELISA 檢測(cè)TNF-α蛋白表達(dá)也明顯下降（211.5±30.39）pg/mL vs.（616.6±42.28）pg/mL，P <0.01。見(jiàn)圖3。
　　2.3過(guò)表達(dá) miR-146a 對(duì) LPS刺激的NR8383細(xì)胞 IRAK-1和TRAF-6蛋白表達(dá)的影響
　　 與對(duì)照組比較，過(guò)表達(dá)miR-146a后，轉(zhuǎn)染組IRAK-1 mRNA增加為（1.16± 0.1）倍，TRAF-6 mRNA增加為（1.19± 0.16）倍，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;轉(zhuǎn)染組IRAK-1 蛋白下降為（0.73±0.05）倍，TRAF-6 蛋白下降為（0.64±0.09）倍，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)圖4。
　　3討論
　　 miR-146a 是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)能夠調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)的微小RNA，當(dāng)機(jī)體存在有感染、腫瘤時(shí)miR-146a 表達(dá)上調(diào)^[7-9]，上調(diào)人單核細(xì)胞白血病細(xì)胞（THP-1細(xì)胞）的 miR-146a 后將負(fù)性調(diào)控炎癥因子的釋放^[10]。研究證實(shí)在 LPS誘導(dǎo)的肺泡巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)中 miR-146a 表達(dá)上調(diào);本研究發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá) miR-146a 后，用 L

　　 PS 刺激肺泡巨噬細(xì)胞， NF-κB 核移位受到抑制，TNF-α mRNA 表達(dá)下降，上清液中 TNF-α 蛋白含量也明顯下降，提示 miR-146a 能夠抑制 LPS 誘導(dǎo)的肺泡巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)。
　　筆者進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá) miR-146a 后，IRAK-1 mRNA 和 TRAF-6 mRNA 表達(dá)量無(wú)明顯變化，而 IRAK-1 和 TRAF-6 蛋白表達(dá)下降。Taganov 等^[11]研究發(fā)現(xiàn) LPS 刺激 THP-1 細(xì)胞后，miR-146a 表達(dá)上調(diào)，并通過(guò)突變?cè)囼?yàn)和熒光素酶報(bào)道基因試驗(yàn)證實(shí)，miR-146a 的靶基因是 TLRs/NF-κB 通路中的兩個(gè)接頭蛋白編碼基因 IRAK-1和TRAF-6。TLRs/NF-κB 是經(jīng)典的炎癥信號(hào)通路，當(dāng)LPS 刺激肺泡巨噬細(xì)胞，可與細(xì)胞膜表面 TLR4 結(jié)合，導(dǎo)致 IRAK-1 自身磷酸化，繼而活化 TRAF-6，使其與轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子 β活化激酶1（TAKl）及 TAKl 的結(jié)合蛋白（TAB）形成復(fù)合物，導(dǎo)致 IκB 磷酸化和降解，最終使 NF-κB 移位進(jìn)入核內(nèi)，啟動(dòng)相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄翻譯生成 TNF-α 炎癥因子^[12-13]。有研究表明過(guò)表達(dá) IRAK-1 能夠使 HEK293 細(xì)胞和 THP-1 細(xì)胞中NF-κB 呈劑量依賴(lài)性增加，同時(shí) TNF-α 也增加，而敲除 IRAK-1 基因能降低 LPS 誘導(dǎo)的 THP-1 細(xì)胞^[14-15]炎癥反應(yīng);同樣過(guò)表達(dá)或者敲除 TRAF-6 也產(chǎn)生相同的作用。
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