關(guān)于采用動物體溫維持儀與仿真熱氣候動物艙建立大鼠經(jīng)典型熱射病的研究
相關(guān)鏈接： 安徽安全網(wǎng) 安徽質(zhì)量網(wǎng) 安徽論文網(wǎng) 安徽資訊網(wǎng)
作者單位：510515 廣州，南方醫(yī)科大學附屬武漢臨床學院（李慧敏、陳芳、唐忠志）;廣州軍區(qū)武漢總醫(yī)院急診科（陳曉娟、付煒、唐忠志）
通信作者：唐忠志，Email：zhzhtang@163.com
【摘要】目的比較應(yīng)用動物體溫維持儀與仿真熱氣候動物艙建立的大鼠經(jīng)典型熱射�。–HS）模型的異同。方法雄性SPF級Wistar大鼠24只，隨機（隨機數(shù)字法）分為室溫對照（C-C）組、高溫對照（HS-C）組、高溫麻醉（HS-A）組。HS-C和HS-A 組大鼠分別使用仿真熱氣候動物艙和動物體溫維持儀行35 ℃熱暴露，監(jiān)測各組大鼠動脈收縮壓（SBP）、核心體溫（Tc）變化，記錄發(fā)病時間，比較兩組大鼠白細胞（WBC）計數(shù)、C反應(yīng)蛋白（CRP）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素-1β（IL-1β）等炎癥指標變化及大腦、肺、肝、小腸、腎等主要器官病理改變。結(jié)果HS-A組大鼠發(fā)病時間比HS-C組明顯縮短[（40.0 ± 4.3） min vs.（110.1 ± 5.3）min，P<0.01]，發(fā)病時SBP及Tc比HS-C組低（159.1 ± 5.91） mmHg vs.（174.54 ± 5.77） mmHg（1 mmHg=0.133 kPa），P< 0.01;（43.5 ± 0.4） ℃vs.（44.4 ± 0.2） ℃，P< 0.01）。建模后兩組大鼠WBC、CRP、TNF-α、IL-1β水平較C-C組均顯著升高（P<0.01），且HS-A組炎性因子水平比HS-C組低（P<0.01），但WBC計數(shù)差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）;兩組大鼠大腦、肺、肝、小腸、腎等主要器官病理無明顯改變。結(jié)論應(yīng)用動物體溫維持儀建立大鼠CHS模型與仿真熱氣候動物艙法差異無統(tǒng)計學意義，并且能夠明顯縮短建模時間、節(jié)約成本，是一種簡易、可靠而又經(jīng)濟的模型建立方法，可以替代仿真熱氣候動物艙法。
【關(guān)鍵詞】】熱射病;動物模型;大鼠動物;體溫維持儀;仿真熱氣候動物艙
Comparison between animal temperature controller and artificial climate chamber employed for the establishment of classical heat
Li Huimin， Chen Xiaojuan， Chen Fang， Fu Wei， Tang Zhongzhi. Wuhan Clinical Institute Affiliated to Southern Medical University， Guangzhou 510515， China
Corresponding author： Tang Zhongzhi， Email：zhzhtang@163.com
【Abstract】ObjectiveTo investigate the differences between animal temperature controller （ATC） and artificial climate chamber （ACC） used for the establishment of classical heat stroke （CHS） rat model. MethodsTwenty-four male specific pathogen-free Wistar rats were randomly（random number） and equally assigned to three groups， namely room temperature control （C-C） group，heat stroke under conscious state （HS-C） group， and heat stroke under anesthesia （HS-A） group. Rats of HS-C or HS-A group were placed into ACC or ATC， then exposed to 35 ℃ heat stress. The systolic blood pressure （SBP） and core body temperature （Tc） were monitored. The time required for onset of HS was recorded. The white blood cell count （WBC） in peripheral blood and serum levels of C-reactive protein （CRP）， tumor necrosis factor-alpha （TNF-α） and interleukin-1 beta （IL-1β） were measured. The histopathological changes of major organs were also confirmed by hematoxylin-eosin （HE） staining. ResultsThe onset time in HS-A group was significantly shorter than that in HS-C group [（40.0 ± 4.3）min vs.（110.1 ± 5.3）min，P<0.01]. The SBP and Tc at this moment were lower in HS-A group[ （159.1 ± 5.91） mmHg vs.（174.54 ± 5.77）mmHg，P<0.01;（43.5 ± 0.4）℃ vs.（44.4 ± 0.2）℃，P<0.01]. The WBC， CRP， TNF-α and IL-1β levels of these two HS groups were dramatically elevated compared with C-C group （P<0.01）. The inflammatory cytokines levels in HS-A group were significantly lower than those in HS-C group （P<0.01）， but there was no difference in WBC between them （P>0.05）. However， there was no obvious difference in histopathological change in major organ observed between HS-A and HS-C groups. ConclusionsIn comparison of these two methods， ATC is similar to ACC in respect of the establishment of CHS rat model. ATC is quicker in onset of HS， and more simplified and economical than ACC and could substitute ACC.
【Key words】Heat stroke; Experiment animal model; Rat;Animal temperature controller;Artificial climate chamber
熱射�。╤eat stroke，HS） 是一種急性熱致疾患，典型臨床表現(xiàn)為高熱（>40 ℃） 、無汗和意識障礙<sup>[1]</sup>，病死率高達10%～50%<sup>[2-4]</sup>，即便幸存者也有約30%遺留永久性神經(jīng)系統(tǒng)及肢體功能障礙<sup>[5]</sup>。按發(fā)病原因不同分為經(jīng)典型熱射病（classical heat stroke， CHS）和勞力型熱射�。╡xertional heat stroke， EHS）<sup>[1]</sup>。隨著全球氣候變暖和城市熱島效應(yīng)加劇，夏季極端氣候不斷出現(xiàn)，HS的發(fā)生率和病死率明顯上升<sup>[6-9]</sup>，已經(jīng)成為嚴重威脅公共健康的疾病之一。目前HS的發(fā)病機制尚不清楚，而HS動物模型的建立對闡明其機制具有重要意義。傳統(tǒng)的CHS動物模型建立方法是將大鼠置于仿真熱氣候動物艙內(nèi)、模擬高溫高濕環(huán)境促使其發(fā)病。然而仿真熱氣候動物艙設(shè)備價格昂貴、體積龐大，因而限制了其應(yīng)用。而動物體溫維持儀建模時間短、成本低、實驗條件要求相對降低，具有廣泛應(yīng)用的潛在價值，但目前尚無兩種方法對比的研究。因此，本研究旨在比較兩種建模方法的異同，評估動物體溫維持儀建模方法的應(yīng)用價值。
1材料與方法
1.1主要儀器設(shè)備及試劑
仿真熱氣候動物艙（南方醫(yī)科大學公共衛(wèi)生與熱帶醫(yī)學學院提供），PowerLab數(shù)據(jù)采集分析系統(tǒng)（澳大利亞ADInstruments公司），SS-20-2型動物體溫維持儀（安徽淮北正華生物儀器設(shè)
1.2實驗動物及分組
8～10周齡SPF級雄性Wistar大鼠24只（購于南方醫(yī)科大學實驗動物中心），體質(zhì)量220～250 g，于南方醫(yī)院實驗動物中心適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，環(huán)境溫度（25±1）℃，相對濕度（60±5）%，自由攝食、進水。所有大鼠在實驗前1周接受PowerLab數(shù)據(jù)采集分析系統(tǒng)的無創(chuàng)血壓測量訓練，頻率為3次/d。實驗大鼠隨機（隨機數(shù)字法）分為3組，每組8只，分別為室溫對照（C-C）組、高溫對照（HS-C）組、高溫麻醉（HS-A）組。
1.3實驗方法
HS-A組大鼠以10%水合氯醛3 mL/kg腹腔注射麻醉，麻醉深度以疼痛反射消失，呼吸、心率平穩(wěn)為標準，穩(wěn)定5 min后進行后續(xù)實驗。實驗期間所有大鼠禁食、禁水，室溫維持在（25±1）℃。C-C組置于室溫自由活動; HS-C組置于預(yù)設(shè)干球溫度（35±0.5）℃、濕球溫度（27±0.5）℃的仿真熱氣候動物艙內(nèi)進行熱暴露;HS-A組麻醉后置于預(yù)設(shè)溫度為35 ℃的動物體溫維持儀的電熱毯內(nèi)，并保證大鼠軀體所有部分均未外露，根據(jù)大鼠意識狀態(tài)適時酌量增加水合氯醛注射。
1.4監(jiān)測指標
大鼠分別于實驗開始前（0 min）、實驗開始后每隔5 min連接PowerLab數(shù)據(jù)采集分析系統(tǒng)監(jiān)測大鼠核心體溫（Tc，以直腸溫度代替）、動脈收縮壓（SBP，以尾動脈收縮壓代替），直至SBP上升至峰值后開始下降作為大鼠HS發(fā)生的標志，記錄大鼠發(fā)病時間及Tc。大鼠發(fā)生HS后，立刻將其轉(zhuǎn)移至室溫環(huán)境。所有大鼠于建模前1 d、建模結(jié)束時麻醉后經(jīng)內(nèi)眥靜脈采取1.5 mL血液（代表外周血），其中0.5 mL使用全自動血液分析儀進行白細胞（WBC）計數(shù)，其余1 mL離心后取上清液，ELISA檢測血清CRP、TNF-α、IL-1β濃度;建模結(jié)束時麻醉后開顱、開腹，觀察各組大鼠大腦、肺、肝、小腸、腎等主要器官大體病變，并留取相應(yīng)標本行蘇木精-伊紅（HE）染色，觀察組織病變。
1.5統(tǒng)計學方法
實驗數(shù)據(jù)使用SPSS 19.0進行統(tǒng)計學分析。計量資料用均數(shù)± 標準差（x±s）表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，多樣本均數(shù)間的多重比較采用LSD-t檢驗;計數(shù)資料以頻數(shù)和率表示，組間比較采用χ2檢驗。以P< 0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。
2結(jié)果
2.1發(fā)病時間、SBP及Tc變化
HS-A組大鼠發(fā)病時間比HS-C組明顯縮短[（40.0 ± 4.3） min vs.（110.1 ± 5.3） min，t=-25.686， P<0.01]，發(fā)病時SBP及Tc比HS-C組低[（159.1 ± 5.91） mmHg vs.（174.54 ± 5.77） mmHg，t=5.519， P< 0.01;（43.5 ± 0.4） ℃vs.（44.4 ± 0.2） ℃，t=-5.872， P< 0.01]（圖1）。
2.2建模前后三組大鼠炎癥相關(guān)指標比較
HS-A組與HS-C組大鼠建模后外周血WBC計數(shù)、CRP、TNF-α、IL-1β等炎癥相關(guān)指標升高，與建模前相比差異具有統(tǒng)計學意義（P< 0.01）。建模后HS-A組大鼠CRP、TNF-α、IL-1β等炎性因子水平比HS-C組低[（14.88 ± 2.56） μg/mL vs.（20.86 ± 2.99）μg/mL，P< 0.01;（75.38 ± 1.84） pg/mL vs.（83.38 ± 3.52）pg/mL，P< 0.01;（160.07 ± 4.85） pg/mL vs.（173.42 ± 3.82）pg/mL，P< 0.01]，而兩組大鼠WBC計數(shù)差異無統(tǒng)計學意義[（13.73 ± 2.20）×109 L-1 vs. （13.92 ± 1.64） ×109 L-1，P=0.849]見圖2。
2.3兩組模型大鼠主要臟器病理改變
�。�1）大體改變：與C-C組大鼠相比，HS-A和HS-C組大鼠腦體積增加，腦回變寬、扁平，腦溝變淺、窄，白質(zhì)水腫明顯;雙肺腫脹，呈暗紅色，可見散在出血點及大片出血斑;肝臟腫大，包膜緊張，表面光滑，色暗紅;小腸缺血、腫脹，色蒼白，蠕動減弱;腎臟體積略增大，被膜稍緊張，色暗紅，縱切面可見皮質(zhì)缺血明顯。（2）鏡下：與C-C組大鼠相比，HS-A和HS-C組大鼠腦組織疏松，細胞和血管周圍間隙變大，神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細胞腫脹、胞質(zhì)淡染，部分神經(jīng)元出現(xiàn)核固縮、胞體縮小變形、尼氏小體消失、胞質(zhì)深紅染，即紅色神經(jīng)元;局部可見噬神經(jīng)現(xiàn)象（圖3）。肺間質(zhì)毛細血管擴張、充血、大量炎性細胞浸潤，可見散在點狀出血;微血管內(nèi)可見混合血栓形成和白細胞栓塞;在肺呼吸性細支氣管、肺泡管的內(nèi)表面可見透明膜形成;肺泡明顯擴張，上皮細胞腫脹、脫落，肺泡間隔明顯增厚并斷裂，相鄰肺泡融合（圖4）。肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，肝細胞大片水腫，胞質(zhì)疏松、淡染，呈半透明狀，以肝小葉中央靜脈周圍為重;部分肝細胞可見核固縮、碎裂、溶解;門管區(qū)可見大量炎性細胞浸潤;微血管內(nèi)可見紅細胞瘀滯、混合血栓形成（圖5）。小腸壁水腫、增厚，絨毛結(jié)構(gòu)紊亂、破壞，上皮細胞可見變性、壞死、脫落，局部大量炎性細胞浸潤（圖6）。腎小球無明顯改變，腎小管上皮腫脹，部分細胞壞死、脫落，管腔內(nèi)可見管型形成，間質(zhì)水腫、散在出血，炎性細胞浸潤不明顯（圖7）。
2.4HS-A組與HS-C組模型病死率比較
HS-A組大鼠在熱暴露過程中死亡1只，HS-C組在熱暴露過程中死亡1只、熱暴露結(jié)束時死亡1只。兩組病死率差異具有統(tǒng)計學意義（χ2=6.250，P=0.012）。
3討論
本研究應(yīng)用動物體溫維持儀所建立的大鼠模型（HS-A組）大體及鏡下病理改變與使用仿真熱氣候動物艙所建立模型（HS-C組）并無明顯差異，而HS-A組大鼠的炎癥因子水平較低、病死率S-A組大鼠發(fā)病時SBP及Tc比HS-C組大鼠低。
兩種方法所建立模型炎癥反應(yīng)及病理改變均符合HS的病理生理改變<sup>[5]</sup>。HS-A組大鼠病死率較低，可能與炎性因子水平較低有關(guān)。因其處于麻醉狀態(tài)，機體應(yīng)激能力明顯下降、發(fā)生免疫抑制，加之麻醉本身的抗炎作用[10]，導致炎癥反應(yīng)減弱;還可能因?qū)嶒灅颖玖枯^小而導致統(tǒng)計學差異。該組大鼠發(fā)病時SBP及Tc比HS-C組大鼠低可能與其處于麻醉狀態(tài)導致血管張力降低、血壓及體溫調(diào)節(jié)能力下降<sup>[11-13]</sup>有關(guān)。HS-A組炎性因子水平較HS-C組低，但兩組大鼠器官損傷并無明顯差異，這與HS早期以直接熱損傷為主<sup>[5]</sup>有關(guān)。
目 前建立大鼠CHS模型的方法主要有仿真熱氣候動物艙法<sup>[14-15]</sup>和電熱毯包裹法[4， 16]等。本研究方法即屬于電熱毯包裹法。從整體環(huán)境的模擬來看，仿真熱氣候動物艙具有溫度、濕度、光照可控的特點，能夠模擬自然環(huán)境;且建模過程中大鼠處于清醒狀態(tài)，更接近自然發(fā)病過程，但其建立模型所需成本及條件要求很高，國內(nèi)許多實驗室都未能達到，因此限制了其應(yīng)用。而電熱毯包裹法建立模型時大鼠需處于麻醉狀態(tài)，同時缺乏濕度及光照的調(diào)節(jié)，即大鼠整個發(fā)病過程處于一種非自然狀態(tài)，這就不能觀察大鼠發(fā)病過程中的癥狀變化。但因其建模時間短、成本低、實驗條件要求相對降低，因而也被廣泛采用。而且將大鼠麻醉之后再建立模型能夠減輕動物所遭遇的痛苦，更符合動物倫理、更人道。目前關(guān)于這兩種方法應(yīng)用的比較尚未見報道。本研究通過對比兩種建模方法，證實應(yīng)用動物體溫維持儀建立大鼠CHS模型與仿真熱氣候動物艙法無明顯差異，并且能夠明顯縮短建模時間、節(jié)約成本，是一種簡易、可靠而又經(jīng)濟的大鼠CHS模型建立方法，可以代替仿真熱氣候動物艙法。
參考文獻
[1]Bouchama A， Knochel JP. Heat stroke[J]. N Engl J Med，2002，346（25）：1978-1988.
[2] Prevention CFDC. Heat Illness and Deaths — New York City， 2000-2011[R]. Morbidity and mortality weekly report，2013，62（31）：617-635.
[3] Levine M ， Lovecchio F， Ruha A， et al. Influence of drug use on morbidity and mortality in heatstroke[J]. J Med Tox， 2012，8（3）：252-257.
[4] Yamakawa K， Matsumoto N， Imamura Y， et al. Electrical vagus nerve stimulation attenuates systemic inflammation and improves survival in a rat heatstroke model[J]. PLoS One，2013，8（2）：e56728.
[5] Leon LR， Helwig BG. Heat stroke： Role of the systemic inflammatory response[J]. J App Phys，2010，109（6）：1980-1988.
[6] Bai L， Ding G， Gu S， et al. The effects of summer temperature and heat waves on heat-related illness in a coastal city of China， 2011-2013[J]. Envir Res，2014，132（）：212-219.
