樟樹籽仁蛋白的物理性質(zhì)及安全性的研究
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許海波1，代紅發(fā)2，李露敏2，肖彥駿2，王報貴2*
1．天津體育學(xué)院運動人體科學(xué)研究所（天津300381）；2．南昌大學(xué)食品學(xué)院國家重點實驗室（南昌330047）
摘要開發(fā)樟樹籽仁蛋白作為一種新型植物蛋白資源。以石油醚低溫脫脂的樟樹籽仁為原料，采用Osborne法對樟樹籽仁蛋白進(jìn)行分級，得到清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白4種組分。為了較全面系統(tǒng)地了解樟樹籽蛋白進(jìn)行理化性質(zhì)及動物毒性的測定。結(jié)果表明，樟樹清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白分別占總蛋白的25.64%,23.51%，2.32%和18.39%;等電點分別為3.1，3.5，3.3和4.5;變性溫度分別為45.35℃，46.15℃，43.53℃和52.56℃;清蛋白、球蛋白和谷蛋白的必需氨基酸含量豐富，醇溶蛋白含量較低：清蛋白和谷蛋白表面較規(guī)則，球蛋白和醇溶蛋白表面發(fā)亮；清蛋白、球蛋白和谷蛋白的二級結(jié)構(gòu)主要為β-折疊，醇溶蛋白主要為無規(guī)卷曲。MTT和ELISA測定結(jié)果表明，在推薦膳食濃度(1.2 g/kg)下不會對BALB/c小鼠肝細(xì)胞和脾細(xì)胞引起凋亡及免疫炎癥的反應(yīng)，說明在動物水平上樟樹籽仁蛋白是安全無毒的。試驗對樟樹籽仁分離蛋白的研究，為樟樹籽仁蛋白質(zhì)資源的開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)，也為其他植物蛋白質(zhì)的研究提供理論依據(jù)。
關(guān)鍵詞樟樹籽蛋白：Osborne分級：功能性質(zhì)；動物毒性
樟樹是我國特產(chǎn)珍貴木材和經(jīng)濟(jì)林樹種，作為常綠綠化樹種，在我國黃河以南地區(qū)樟樹栽種數(shù)量和面積逐年增加，樟樹籽的產(chǎn)量逐年提高。樟樹的根、莖、葉和果實等都是寶物，各部分的經(jīng)濟(jì)利用價值高，用途較廣，其主副產(chǎn)品廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、軍用、建筑等各個方面。近年來，對樟樹的研究目前主要集中在藥用價值研究、生態(tài)學(xué)研究和其工業(yè)價值研究。但除此之外，對其蛋白質(zhì)的開發(fā)研究較少，每年秋末冬初，大量的樟樹籽散落于城鄉(xiāng)各地，不僅浪費資源且污染環(huán)境，加重環(huán)保負(fù)擔(dān)。樟樹籽仁油提取過后，剩余的殘渣還含有非常多的蛋白質(zhì)。在藥用或者食用方面，樟樹籽仁蛋白作為一種新型植物蛋白資源，具有巨大的開發(fā)潛力和良好的應(yīng)用價值。
人們在日常生活中，食用蛋白劃分為兩大類：動物性蛋白和植物性蛋白。植物蛋白所占的食用比例較高，達(dá)70%以上。植物蛋白種類多，資源豐富，易于消化，具有一定的保健功能，其中一些植物蛋白質(zhì)中的氨基酸對于某些疾病還有一定的療效。而動物蛋白含有較高的脂肪和膽固醇，食用過多會對身體健康不利，發(fā)到國家就存在大量攝入動物蛋白導(dǎo)致肥胖、
糖尿病以及動脈粥樣硬化等發(fā)病率增加的問題。營養(yǎng)學(xué)家認(rèn)為，食物中應(yīng)該平衡攝人動物蛋白和植物蛋白，從而減少脂肪和膽固醇的積累。由于植物蛋白的諸多優(yōu)點，再加上其種類多，在許多國家中人們會將植物蛋白作為飲食的一部分，提倡多食用植物蛋白。我們國家也在大力開發(fā)植物蛋白，但是處于起步階段，大部分還是依靠進(jìn)口。隨著我國人口的不斷增長，會導(dǎo)致食物資源短缺，因此新的植物蛋白資源開發(fā)必不可少，對于應(yīng)對食物資源的短缺尤為重要。
因此，有必要加強(qiáng)對樟樹籽仁蛋白的研究，對樟樹籽仁進(jìn)行多層次的開發(fā)利用，提高樟樹籽的經(jīng)濟(jì)利用價值有重要的意義。就樟樹籽仁分離蛋白加以研究，不僅可以提高產(chǎn)品的附加值，為資源的再利用提供新的途徑，也期望能為日后樟樹籽仁蛋白的規(guī)模應(yīng)用提供理論依據(jù)。
1材料與方法
1.1主要材料
樟樹籽：采摘于南昌大學(xué)校園；D44mm透析袋：上海源葉生物科技有限公司；牛血清蛋白：上海奧博生物科技有限公司；考馬斯亮藍(lán)G-250:國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；氫氧化鈉( AR)、鹽酸(AR)、無水乙醇( AR)、石油醚(AR)：西隴化工股份有限公司；DMEM高糖培養(yǎng)基（含雙抗）、胰蛋白酶-EDTA消化液(0.25%)：索萊寶生物科技有限公司；噻唑蘭( MTT)：北京賽馳生物科技有限公司；BALB/c,小鼠：南昌實驗動物中心；IL-6細(xì)胞因子試劑盒( 48T)：生工生物工程（上海）股份有限公司；IL-10，1B，MCP-1．TNF-a細(xì)胞因子試劑盒( 48T)：伊萊瑞特生物科技有限公司；胎牛血清（標(biāo)準(zhǔn)級）：依科賽科技有限公司；T25培養(yǎng)瓶：賽業(yè)生物科技有限公司。
1.2主要儀器與設(shè)備
WF2765PC紫外可見分光光度計：上海光譜儀器有限公司；BS223電子天平：德國賽多利斯有限公司；PHS-2F型pH計：上海精密科學(xué)儀器有限公司雷磁儀器廠；TDL-5型低速離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；SHB-III循環(huán)水式多用真空泵：鄭州長城科工貿(mào)有限公司；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；R系列旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海申生科技有限公司；索氏提取器：南昌大學(xué)玻璃儀器廠；XMTE-8112電熱恒溫水浴鍋：上海精宏實驗設(shè)備有限公司；FOSS全自動凱氏定氮儀：江蘇科學(xué)儀器有限公司；調(diào)溫型電熱套：北京科偉永興儀器有限公司；85-2恒溫磁力攪拌器：江蘇中大儀器廠；SX2-4-10型馬弗爐：長沙遠(yuǎn)東電爐場；S-433D氨基酸分析儀：德國SYKAM公司；DSC差示掃描量熱儀：美國PE公司；掃描電子顯微鏡：日立儀器公司；FTIR-Nicolet 5700傅里葉變換紅外光譜儀：美國熱電尼高力公司；DNM-9602酶標(biāo)分析儀：北京普朗新科技有限公司；二氧化碳培養(yǎng)箱、低速離心機(jī)（湘儀離心機(jī)）、倒置光學(xué)顯微鏡：Thermo公司
1.3.1樟樹籽仁蛋白組分的提取
參照張春紅Osborne蛋白分級提取方法分別用蒸餾水、鹽溶液、乙醇溶液和堿液作為提取劑對樟樹籽仁蛋白進(jìn)行提取，按蛋白質(zhì)的不同溶解度將蛋白質(zhì)分為四類。蛋白質(zhì)含量的測定采用微量凱氏定氮法，參照GB/T 5009.5-2003。
1.3.2樟樹籽仁四種分離蛋白等電點的測定
將4種樟樹籽仁蛋白的提取液用分別用0.5 mo/L的鹽酸調(diào)pH為2.9，3.1，3.3，3.5，3.7，3.9，4.1，4.3，4.5, 4.7，4.9和5.1，使蛋白質(zhì)沉淀，離心后取上清液，考馬斯亮藍(lán)法測定溶液的吸光度，吸光度最小的點對應(yīng)的pH即為等電點。
1.3.3樟樹籽仁四種分離蛋白變性溫度的測定
試驗采用美國PE公司的DSC（差示掃描量熱儀）對樟樹籽仁清蛋白，球蛋白，醇溶蛋白及谷蛋白干粉進(jìn)行變形溫度的測定。分別精確稱取一定量樟樹籽仁四種蛋白干燥樣品于鋁盒中，壓緊，以空白鋁盒作為對照，在氮氣流速20 m L/min，掃描溫度范圍20℃～120℃，升溫速率為10℃/min的條件下進(jìn)行測定。對測出的圖譜進(jìn)行分析，峰值點溫度即為蛋白的變性溫度。
1.3.4樟樹籽仁四種分離蛋白氨基酸組成成分分析
分別精確稱取樟樹籽仁四種蛋白各20 mg，置于水解管中，加入10 m L 6 mol/L的鹽酸，利用氮吹儀吹人氮氣將空氣排空，用酒精燈封管。放于110℃烘箱中水解24 h，水解完成后冷卻至室溫，混勻后打開水解管，過濾除去雜質(zhì)，用超純水定容至50 m L。取1m L樣液置于干凈的培養(yǎng)皿中，60 ℃水浴蒸干，重復(fù)一次。加入3 m L樣品緩沖液溶解，混勻后用0.22
μm濾膜過濾，利用氨基酸自動分析儀上機(jī)分析。
1.3.5樟樹籽仁四種分離蛋白表面形態(tài)的掃描電鏡( SEM)觀察
利用S-3440N型日立掃面電鏡對處理好的四種樟樹籽仁蛋白樣品在加速電壓為20 kV的條件下進(jìn)行拍照觀察。
1.3.6樟樹籽仁四種分離蛋白紅外光譜分析
準(zhǔn)確稱取適量樟樹籽仁四種蛋白樣品，壓片后置于紅外光譜儀中作全波長( 400～4 000 cm-1)掃描。
1.3.7 MTT法測定細(xì)胞活性
選取毛色光澤，健康活潑的BALB/c小鼠50只（6～8周，1 8±2g，雌性），隨機(jī)分為5組（對照組，清蛋白，球蛋白，醇溶蛋白和谷蛋白組，每組10只），分籠飼養(yǎng)。飼養(yǎng)房溫度恒定在20℃，濕度45%～55%，并保持室內(nèi)空氣清新。自由采食，飲水，平衡一周后開始試驗。各試驗組分別將按1.2 g/kg的比例進(jìn)行灌胃，正常對照組給予等量的生理鹽水。每天灌胃一次，連續(xù)灌胃28d。灌胃結(jié)束后，所有小鼠禁食過夜，次日摘眼球取血，3000 r/min離心10 min后取血清（-80℃備用），同時取同等質(zhì)量的老鼠肝臟和脾臟采用組織研磨制備單細(xì)胞懸液，用無菌PBS洗滌3次后，迅速加入含有10%的胎牛血清及雙抗（青霉素和鏈霉素）的DMEM培養(yǎng)基，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，每孔加入100μL，鋪板使待測細(xì)胞調(diào)密度至1 000～10 000／孔，加入20pU/孔MTT溶液(5 mg/m L，即0.5%MTT，5% CO2，37℃孵育培養(yǎng)4h。吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液，加入15μL／孔二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀OD492nm處測量各孔的吸光度。
1.3.8 ELISA檢測細(xì)胞上清中免疫因子的含量
灌胃后分離得到的血清，2 000 r/min，離心5 min取上清按照試劑盒的說明書分別對IL-6、11- 10、IL-lβ、MCP-1和TNF-a進(jìn)行含量(pg/m L)的測定。在酶聯(lián)免疫檢測儀OD450nm處測量各孔的吸光度。
2結(jié)果與分析
2.1樟樹籽仁蛋白組分的分布
從圖1的數(shù)據(jù)來看，樟樹籽仁中含量最多的蛋白質(zhì)為谷蛋白，占蛋白總量的30.14%，清蛋白和球蛋白次之，分別占25.64%和23.51%，樟樹籽仁醇溶蛋白含量最少，占2.32%。還有18.39%的不溶性蛋白殘留在殘渣中。
2.2樟樹籽仁四種分離蛋白等電點測定結(jié)果
由圖2可以看出，清蛋白提取液的吸光度隨著pH的逐漸增加呈現(xiàn)先減少后增加的趨勢，在pH為3.1時，清蛋白提取液的吸光度最小，說明在此pH條件下，清蛋白在溶液中的含量較少，溶解性較差，沉淀效果較好，此點即為清蛋白的等電點；同理，球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白的等電點分別為pH 3.5，pH3.3和pH 4.5。
2.3樟樹籽仁四種蛋白變性溫度測定結(jié)果
由圖3A可以看出，樟樹籽仁清蛋白蛋白粉（水分含量9.6%）的變性溫度為45.35℃。含水量對蛋白質(zhì)的變性溫度有很大的影響，水分過低或者過高會使峰的形狀發(fā)生變化。樟樹籽仁球蛋白(水分含量8.25%)的變性溫度為46.15℃（圖3B），樟樹籽仁醇溶蛋白（水分含量6.21%）的變性溫度為43.53℃(圖3C)，樟樹籽仁谷蛋白（水分含量8.91%）的變性溫度為52.56℃（圖3D）。
2.4樟樹籽仁四種蛋白氨基酸組成成分分析
由表1可以看出，樟樹籽仁四種蛋白中清蛋白和球蛋白的氨基酸組成比較相似，醇溶蛋白和谷蛋白的氨基酸組成比較相似。四種蛋白質(zhì)都含有較高的谷氨酸和天冬氨酸，這是大部分儲藏蛋白所具有的性質(zhì)。樟樹籽仁清蛋白所含有的總氨基酸和必需氨基酸最高，醇溶蛋白最低。人體所含的九種必需氨基酸在四種蛋白中都有，但含量有差異。必需氨基酸中，與FAO/WHO 2～5歲小孩的推薦模式相比，清蛋白的纈氨酸，異亮氨酸和亮氨酸，球蛋白和醇溶蛋白的組氨酸的含量較高，其他氨基酸含量均低于FAO/WHO 2～5歲小孩的推薦模式。樟樹籽仁清蛋白必需氨基酸的含量均高于FAO/WHO成人推薦模式。球蛋白，醇溶蛋白和谷蛋白中必需氨基酸的含量大部分均高于FAO/WHO成人推薦模式。
2.5樟樹籽仁四種蛋白表面形態(tài)SEM觀察結(jié)果
采用SEM對清蛋白，球蛋白，醇溶蛋白和谷蛋白的表面形態(tài)進(jìn)行拍照觀察，觀察結(jié)果如圖4。樟樹籽仁清蛋白粉末表面形狀比較規(guī)則，顆粒之間較密集，孔徑較�。磺虻鞍妆砻姘l(fā)亮，表面不規(guī)則，呈塊狀，塊狀較大；醇溶蛋白表面發(fā)亮，蓬松，間隙較小；谷蛋白表面凸凹不平，粉末較規(guī)則，似球狀，孔隙較大。
2.6樟樹籽仁四種蛋白紅外光譜分析
樟樹籽仁清蛋白的紅外光譜圖如圖5A所示：從酰胺Ⅲ區(qū)的振動區(qū)和蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系分析可知，樟樹籽仁清蛋白在1238.65 cm-1處有紅外吸收峰，屬于β-折疊結(jié)構(gòu)。在1340 cm-1附近的出現(xiàn)的紅外吸收屬于a-螺旋結(jié)構(gòu)，但是出現(xiàn)的紅外吸收峰較弱。比較兩者可知，樟樹籽仁清蛋白的二級結(jié)構(gòu)中β-折疊結(jié)構(gòu)所占的比例遠(yuǎn)大于a-螺旋結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)。樟樹籽仁球蛋白在1 240.33 cm-1處有紅外吸收峰，屬于β-折疊結(jié)構(gòu)。在1 340 cm-1附近的出現(xiàn)的紅外吸收屬于a-螺旋結(jié)構(gòu)，但是出現(xiàn)的紅外吸收峰較弱（圖5B）。比較兩者可知，樟樹籽仁球蛋白的二級結(jié)構(gòu)中β-折疊結(jié)構(gòu)所占的比例遠(yuǎn)大于a-螺旋結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)，清蛋白和球蛋白的結(jié)構(gòu)相類似。樟樹籽仁醇溶蛋白在1 276.71 cm-1處有紅外吸收峰，屬于無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)。在1 340 cm-1附近的出現(xiàn)的紅外吸收屬于a-螺旋結(jié)構(gòu)，但是出現(xiàn)的紅外吸收峰較弱。可知樟樹籽仁醇溶蛋白屬于無規(guī)卷曲。樟樹籽仁谷蛋白在1 239.09 cm-1處有紅外吸收峰，屬于β-折疊結(jié)構(gòu)。由此可見樟樹籽仁谷蛋白屬于β-折疊。
2.7樟樹籽仁四種蛋白對細(xì)胞活性的測定
樟樹籽仁四種蛋白對灌胃后BALB/c小鼠的脾細(xì)胞和肝細(xì)胞的增值及細(xì)胞活性的影響如圖6所示。灌胃四種蛋白均不會對肝細(xì)胞和脾細(xì)胞的活性存在影響，差異不顯著。
2.8樟樹籽仁四種蛋白對免疫因子的測定
樟樹籽仁蛋白對灌胃后BALB/c小鼠血清中免疫因子的影響如圖7所示。灌胃四種蛋白均不會顯著引起免疫因子IL-6、IL-10、IL-Iβ、MCP-1和TNF-a含量的變化，說明食用樟樹籽仁蛋白后不會促進(jìn)炎癥因子的產(chǎn)生，既不會激活機(jī)體的免疫系統(tǒng)。
3結(jié)論與討論
植物蛋白質(zhì)是人類所需蛋白質(zhì)及營養(yǎng)素的重要來源之一，既能提供能量又能提供機(jī)體所需氨基酸，在食品工業(yè)中的應(yīng)用依賴于其自身的營養(yǎng)價值及理化性質(zhì)。植物蛋白的分離提取過程應(yīng)不破壞其天然活性，并能達(dá)到一定的純度，純度一般在85%～99%。植物蛋白的提取方法一般有堿溶酸沉法、酶法提取、膜分離法和鹽堿浸提法等。堿溶酸沉法雖然可以節(jié)約成本，利于控制，在規(guī)模性生產(chǎn)中得到了廣泛的應(yīng)用，但步驟繁瑣，耗時較長。近年來采用酶法提取蛋白的報道比較多，相比于堿溶酸沉法，酶法提取所需的溫度低，時間短，提取率高，過程中無有害物質(zhì)產(chǎn)生。Anshrullah和R．Sengupta等分別采用酶法提取米糟蛋白、大米濃縮蛋白和米渣蛋白，試驗結(jié)果表明所提取的蛋白無毒，可以作為食品添加劑，但此方法生產(chǎn)成本較高。在工業(yè)生產(chǎn)中膜分離法具有節(jié)約能源，生產(chǎn)成本低，設(shè)備要求低和提取率高等優(yōu)
點。但是由于使用過程中膜易污染，且價格昂貴，因此該技術(shù)尚處于試驗階段，還沒在工業(yè)上進(jìn)行應(yīng)用。上述方法所提取的蛋白都是總蛋白。
試驗采用Osborne根據(jù)蛋白質(zhì)的溶解度不同對樟樹籽蛋白進(jìn)行了系統(tǒng)分類（連續(xù)提取法），所提取的四種蛋白都含有較高的谷氨酸和天冬氨酸，這是大部分儲藏蛋白所具有的性質(zhì)。膳食中蛋白質(zhì)的氨基酸種類對其消化吸收及營養(yǎng)價值有重要的影響，因此用氨基酸自動分析儀對所提取的四種蛋白的氨基酸種類進(jìn)行檢測，結(jié)果表明，球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白中必需氨基酸的含量大部分均高于FAO/WHO成人推薦模式。說明樟樹籽仁蛋白的必需氨基酸滿足機(jī)體對營養(yǎng)成分的需求，是一種營養(yǎng)價值較高的植物蛋白產(chǎn)品。試驗進(jìn)一步通過動物試驗對樟樹籽仁蛋白安全性的確定，結(jié)果表明，灌胃四種蛋白均不會顯著引起免疫因子IL-6、IL-10、IL-Iβ、MCP-1和TNF-a含量的變化，說明食用樟樹籽仁蛋白后不會促進(jìn)炎癥因子的產(chǎn)生，也不會激活機(jī)體的免疫系統(tǒng)，是一種安全無害的健康食品。
樟樹具有廣泛的種植面積，樟樹籽中含有豐富的蛋白質(zhì)（氨基酸組成滿足了FAO/WHO成人推薦模式），是一種安全的新蛋白資源。為樟樹籽仁蛋白在食品中的應(yīng)用，開發(fā)出符合市場需求的蛋白產(chǎn)品提供理論依據(jù)。
