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 崔芹芹1，2，薛建良1，王明清3，姜爾穎1，程怡甜1，楊曉健1，高  宇1，肖新峰1

（1．山東科技大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，山東青島266590;2．青島濱海學(xué)院建筑工程學(xué)院，

 山東青島266555；3．中國(guó)科學(xué)院海洋研究所，山東青島266071）

摘要：原位生物修復(fù)技術(shù)是解決石油污染海洋的重要途徑之一。采集3個(gè)不同海域的海水水樣，并對(duì)其理化性質(zhì)進(jìn)行分析，并在此基礎(chǔ)上通過(guò)外加營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)研究其對(duì)石油烴降解菌生長(zhǎng)、降解石油烴的效果等的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3個(gè)采樣點(diǎn)石油烴降解菌種分布較少，僅分離出6株單菌3個(gè)不同的菌屬。通過(guò)分析海水理化性質(zhì)發(fā)現(xiàn)，石油烴降解菌種的數(shù)量和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)也較少。進(jìn)一步研究不同的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)對(duì)石油烴降解菌生長(zhǎng)的影響發(fā)現(xiàn)，磷氮元素對(duì)石油烴降解菌的生長(zhǎng)具有顯著促進(jìn)作用；另外，添加氮、磷源后菌的降解效果顯著提高，可以達(dá)到47. 7%和49. 6%。初步說(shuō)明適量增加磷、氮元素對(duì)于原位生物修復(fù)石油污染海洋十分重要。

 關(guān)鍵詞：石油烴降解菌；海洋石油污染；原位修復(fù)；營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)

 中圖分類(lèi)號(hào)：X172；TE991 文章編號(hào)：0253 - 4320（2016）03 - 0097 - 04

 DOI:10. 16606/j. cnki. issn 0253 - 4320. 2016. 03. 023

 隨著海上石油開(kāi)發(fā)及遠(yuǎn)洋石油運(yùn)輸?shù)然顒?dòng)的持續(xù)增多，海上溢油／泄油事故等頻發(fā)，海洋石油污染問(wèn)題日益凸顯，直接導(dǎo)致嚴(yán)重的海洋生態(tài)問(wèn)題。

 目前，生物修復(fù)技術(shù)因其處理效果好、成本低、適應(yīng)性強(qiáng)以及無(wú)二次污染等特點(diǎn)，成為處理石油污染區(qū)域生態(tài)修復(fù)最具前景的技術(shù)之一。生物修復(fù)技術(shù)應(yīng)用于其他環(huán)境介質(zhì)的研究較多，如土壤石油污染區(qū)域生態(tài)修復(fù)。然而，與其他環(huán)境介質(zhì)不同，海洋環(huán)境的特殊性導(dǎo)致生物修復(fù)技術(shù)的應(yīng)用受到一定的限制。有研究表明，海水的鹽度超過(guò)3. 5%或低于0.5%都會(huì)影響海洋石油烴降解菌的降解效果。另外，海洋中的其他因素如溫度、潮汐等都會(huì)影響生物修復(fù)的效果。因此，在生物修復(fù)技術(shù)越來(lái)越受到重視的情況下，通過(guò)考察環(huán)境的理化性質(zhì)與土著石油降解菌生長(zhǎng)、代謝等關(guān)系，以進(jìn)一步提出一條切實(shí)可行的土著石油烴降解菌修復(fù)石油污染海洋的生態(tài)的新途徑。

 筆者以采集的不同海域的海水樣品富集并鑒定石油烴降解菌的種類(lèi)，分析海域的理化性質(zhì)與土著石油烴降解菌生長(zhǎng)的關(guān)系。并在此基礎(chǔ)上，通過(guò)添加不同的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，分析其對(duì)該水樣中石油烴降解菌種的增殖情況和降解石油烴效果的影響。

1  實(shí)驗(yàn)材料及方法

1.1  樣品采集

 選擇青島市西海岸部分海域作為石油烴降解菌篩選的海域。其中所有樣品集中來(lái)自于3個(gè)采樣點(diǎn)：黃島客運(yùn)碼頭采樣點(diǎn)(S1)、黃島前灣港采樣點(diǎn)( S2)和唐島灣(S3)，共計(jì)37個(gè)水樣。

1.2菌株的富集及鑒定

1.2.1  菌株的富集

 在無(wú)菌操作臺(tái)中，向錐形瓶中加入一定量無(wú)機(jī)鹽液體培養(yǎng)基，移取所選采集的水樣3 m L，接種到錐形瓶中。之后添加1 m L柴油。將該錐形瓶置于30℃、160 r m p的恒溫培養(yǎng)箱里培養(yǎng)7d。取出錐形瓶，按同樣方法移取3 m L菌液，接種于新配置無(wú)機(jī)鹽液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，同等條件下培養(yǎng)7d；重復(fù)上述步驟3次，即篩選富集完畢。

1.2.2  菌株的純化及鑒定

 利用接種環(huán)從上述富集完畢的菌液中提取一定量菌液，在無(wú)機(jī)固體培養(yǎng)基中劃線。劃線得到的含有菌株的培養(yǎng)基置于30℃恒溫箱中培養(yǎng)3d。從培養(yǎng)基中選擇形體不一樣的進(jìn)行分別挑選，用無(wú)菌液稀釋后，繼續(xù)上述方法培養(yǎng)。重復(fù)上述步驟3—4次，直到固體培養(yǎng)基中只含1種菌為止，完成水樣中石油烴降解菌的分離純化。將獲得的各個(gè)單一菌株進(jìn)行鑒定，通過(guò)UNIQ -10柱式真菌DNA提取裝置進(jìn)行提取，18S rRNA通過(guò)PCR擴(kuò)增儀進(jìn)行擴(kuò)增。

PCR擴(kuò)增完成后使用DNA測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)定。測(cè)定結(jié)果使用BLAST程序和MycoBank中的基因數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，得到結(jié)果。

1.3各種培養(yǎng)基的制備

1.3.1  無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基

 無(wú)機(jī)鹽液體培養(yǎng)基組成：Na2HPO40.6g/L，KH2PO4 0.2 g/L, NaNO3 4.0g/L, MgSO4 0.3g/L,CaCl2 0.01 g/L，F(xiàn)eSO40.01 g/L，酵母粉0.5 g/L，蒸餾水1 000 m L，pH為7.2~7.4。制備固體培養(yǎng)基時(shí)，在此基礎(chǔ)上添加瓊脂15～20 g。

1.3.2各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)培養(yǎng)基

 普通無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基(A):即上述無(wú)機(jī)鹽液體培養(yǎng)基；多碳源培養(yǎng)(B):即在上述無(wú)機(jī)鹽液體培養(yǎng)基基礎(chǔ)上添加0.1 g酵母粉；多氮源培養(yǎng)基(C):即在上述無(wú)機(jī)鹽液體培養(yǎng)基基礎(chǔ)上添加0.4 g NaNO3；多磷源培養(yǎng)基(D):即在上述無(wú)機(jī)鹽液體培養(yǎng)基基礎(chǔ)上添加0. 06 g NaHPO4。

1.4各指標(biāo)的分析方法

1.4.1  海水基本理化性質(zhì)測(cè)定方法

 pH: pH測(cè)定法；鹽度：重量法；含油率：紅外分光光度法；TOC:非色散紅外光譜法；有效氮：紫外分光光度法；有效磷：鉬酸銨分光光度法。

1.4.2海水中石油烴降解菌的菌種數(shù)量測(cè)定方法

 參照最大或然數(shù)( Most probable number，MPN)測(cè)定石油烴降解菌數(shù)量。

1.4.3石油烴降解率測(cè)定方法

 石油烴降解率采用紫外分光光度法測(cè)定。其步驟為：取一定量的待測(cè)海水水樣，加入一定量的25%的硫酸酸化。然后取5 m L已酸化的樣品轉(zhuǎn)移到500 m L的分液漏斗中，并加入5 m L正己烷。振蕩分液漏斗2 min，靜置分層。上層正己烷萃取液移至比色管中，下層水樣放至原水樣中。振蕩原水水樣，重復(fù)上述步驟3次。得到的萃取液在225 nm波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光值。依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線法算出其濃度。石油烴的降解率為：

2結(jié)果與討論

2.1菌株的鑒定

 從每個(gè)待測(cè)樣品中取一定量的水樣加到無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，并添加一定量的柴油作為篩選劑。經(jīng)培養(yǎng)、富集、篩選等步驟后，進(jìn)行PCR -DGGE分析。

 通過(guò)對(duì)DGGE的條帶進(jìn)行切膠回收測(cè)序后，得到了各樣品中的菌種，結(jié)果如表1所示。

 從表1中可以看出，3個(gè)采樣點(diǎn)分類(lèi)出菌株種類(lèi)較少，僅有6株單菌3個(gè)不同的菌屬。3個(gè)不同的菌屬分別是假單胞菌屬（Pseudomona sP．）、動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter sp.）、紅球菌屬（Rhodococcus sp.）等。假單胞菌屬（Pseudomonas sp.）也是報(bào)道中易產(chǎn)生表面活性劑的菌屬。其中，S1采樣點(diǎn)發(fā)現(xiàn)的主要是假單胞菌屬（Pseudomonas sp.），共2種單菌；S2

采樣點(diǎn)分別發(fā)現(xiàn)了假單胞菌屬（Pseudomonas sp.）、動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter sp.）、紅球菌屬(Rhodococcussp.)各1株菌種。

2.2海水理化性質(zhì)分析

 為進(jìn)一步探討所選海域石油烴降解菌種降解石油烴的潛力，首先分析海水理化性質(zhì)，并對(duì)海域的海水理化性質(zhì)進(jìn)行了分析，結(jié)果如表2所示。

 從表2中可以看出，各采樣點(diǎn)采集到的海水水樣中石油烴降解菌的數(shù)量十分有限。S1、S2和S3采樣點(diǎn)中石油烴降解菌的數(shù)量?jī)H分別為( 114±27)、(288 +34)、(47 +18)個(gè)/m L。另外，所研究的海域海水樣品中各營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)較少。其中，有效氮質(zhì)量濃度僅為0. 54~1.85 mg/L，有效磷質(zhì)量濃度僅為0. 105~0.112  mg/L。在水樣中，各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)組成失衡TOC/有效氮最小僅為4.32，TOC/有效磷比僅為71. 94~ 76. 12。

 從石油烴降解菌的數(shù)量和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的質(zhì)量濃度來(lái)看，所選擇的海域中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)質(zhì)量濃度較低和比例失衡是石油烴降解菌的數(shù)量較少的重要原因。2.3不同營(yíng)養(yǎng)鹽添加條件下石油烴降解菌變化情況分析

 為考察營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)對(duì)不同海域石油烴降解菌的影響，從3個(gè)采樣點(diǎn)各選出1個(gè)代表性的海水水樣，從中各取1mL加入到4種不同的培養(yǎng)基中[分別為普通無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基(A)、多碳源培養(yǎng)(B)、多氮源培養(yǎng)基(C)和多磷源培養(yǎng)基(D)]。并分別培養(yǎng)3、6、9d和12 d，測(cè)定石油烴降解菌數(shù)量的變化，其結(jié)果如圖1～圖3所示。

 從圖1～圖3可以看出，3個(gè)不同采樣點(diǎn)的水樣中石油烴降解菌在不同的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)后均顯著增多。以采樣點(diǎn)S1為例，在A、B、C、D4種培養(yǎng)基分別培養(yǎng)12 d后，石油烴降解菌數(shù)量從120個(gè)分別增大到5900、8900、12700個(gè)和20900個(gè)。從這個(gè)數(shù)值上來(lái)看，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)對(duì)生物生長(zhǎng)的促進(jìn)作用也不盡相同。特別是，在增加磷源的培養(yǎng)基中，石油烴降解菌生長(zhǎng)迅速，經(jīng)過(guò)12d的培養(yǎng)，石油烴降解菌生長(zhǎng)高出普通無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中的4倍。當(dāng)基本碳源足夠的情況下，其促進(jìn)石油烴降解菌生長(zhǎng)的作用大小排序?yàn)椋毫自?#62;氨源>碳源。其他采樣點(diǎn)水樣中石油烴降解菌生長(zhǎng)也有同樣的規(guī)律。

 另外，不同采樣點(diǎn)水樣中石油烴降解菌的生長(zhǎng)存在差異。以同一種培養(yǎng)基為例，在無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)條件下，S1、S2和S3采樣點(diǎn)的石油烴降解菌經(jīng)過(guò)12 d培養(yǎng)后，石油烴降解菌增殖迅速，分別增加了49、24倍和34倍。即使在不同的培養(yǎng)條件下，各采樣點(diǎn)生物增殖速度也不相同。在多磷培養(yǎng)條件下，12 d后，S1、S2和S3水樣中的石油烴降解菌數(shù)量分別是20 900、24 500個(gè)和12 100個(gè)。說(shuō)明不同的石油烴降解菌對(duì)培養(yǎng)條件的要求和適應(yīng)情況差異較大。

3.3不同營(yíng)養(yǎng)條件下石油烴降解效果差異分析

 以S1采樣點(diǎn)的水樣為研究對(duì)象，通過(guò)無(wú)機(jī)培養(yǎng)基進(jìn)行富集培養(yǎng)。當(dāng)生物濃度達(dá)到一定量之后，分別取同樣數(shù)量的石油烴降解菌懸浮液4份加入到A、B、C、D4種培養(yǎng)基中，并分別添加一定數(shù)量的柴油作為降解目標(biāo)物質(zhì)，保證柴油的質(zhì)量濃度為10 mg/L。經(jīng)過(guò)7d培養(yǎng)降解后，對(duì)殘余的柴油進(jìn)行定量分析，結(jié)果如表3所示。

 從表3中可以看出，在不同的培養(yǎng)條件下，菌群的降解效果差異較大。其中，在無(wú)機(jī)普通培養(yǎng)條件下，石油降解率達(dá)到34.5%，然而在碳源充足，添加氮源和磷源的條件下，菌群的降解效果顯著提高，分別達(dá)到47. 7%和49. 6%。這也說(shuō)明氮磷元素對(duì)于菌群降解石油烴的重要性。

3結(jié)論

 通過(guò)采集3個(gè)不同海域的海水水樣，分析了石油烴降解菌種的種類(lèi)，并進(jìn)一步分析了添加營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)對(duì)各采樣點(diǎn)石油烴降解菌種的生長(zhǎng)和降解石油烴效果的差異。

 (1)通過(guò)對(duì)3個(gè)采樣點(diǎn)水樣的分析發(fā)現(xiàn)，3個(gè)采樣點(diǎn)石油烴降解菌種分布較少，僅分離出6株單菌3個(gè)不同的菌屬。分別是假單胞菌屬（Pseudomonassp．）、動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter  sp.）、紅球菌屬（Rhodococcus sp.）。

 (2)通過(guò)分析3個(gè)采樣點(diǎn)采集水樣的海水理化性質(zhì)發(fā)現(xiàn)，石油烴降解菌種的數(shù)量較少，僅為(114±27)、(288±34)、47 +18個(gè)/m L。各樣品中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)也較少。有效氮質(zhì)量濃度僅為0. 54~1.85 mg/L，有效磷質(zhì)量濃度僅為0.105~0. 112 mg/L。而且，各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)組成失衡C/N最小僅為4. 32，C/P僅為71. 94~ 76. 12。這說(shuō)明營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的缺失對(duì)石油烴降解菌的生長(zhǎng)有限制作用。

 (3)通過(guò)添加不同營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，各采樣點(diǎn)的水樣中石油烴降解菌在不同的培養(yǎng)條件下均顯著增多。這說(shuō)明營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)對(duì)生物生長(zhǎng)的促進(jìn)作用也不盡相同。當(dāng)基本碳源足夠的情況下，其促進(jìn)石油烴降解菌生長(zhǎng)的作用的大小排序?yàn)椋毫自?#62;氮源>碳源。另外，不同采樣點(diǎn)水樣中石油烴降解菌的生長(zhǎng)存在差異。

 (4)在不同的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)條件下，石油烴降解菌的降解效果差異較大。其中，在無(wú)機(jī)普通培養(yǎng)條件下，石油降解率可以達(dá)到34.5%，然而在碳源充足的條件下，添加氮源和磷源的條件下菌群的降解效果顯著提高，分別達(dá)到47. 7%和49. 6%。這也說(shuō)明氮磷元素對(duì)于菌群降解石油烴的重要性。