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徐剛1，周小軍2，宋禾1，王進(jìn)2，法云智2，葉華虎2

1．成都農(nóng)業(yè)科技職業(yè)學(xué)院畜牧獸醫(yī)分院，四川成都620038；2．軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，北京100071

[摘要]  目的：探討自裂解肽T2A對(duì)猴B病毒g D和g B蛋白共表達(dá)的可行性。方法：利用一點(diǎn)褐翅蛾病毒(Ta V)的2A元件(T2A)連接猴B病毒膜蛋白g D和g B基因，構(gòu)建多順?lè)醋颖磉_(dá)質(zhì)粒，制備CHO-S工程細(xì)胞，采用Western印跡和ELISA檢測(cè)蛋白表達(dá)及重組蛋白的免疫學(xué)特性。結(jié)果：g D和g B蛋白實(shí)現(xiàn)了共表達(dá)且保持了獨(dú)立和完整的分子結(jié)構(gòu)，但g B的表達(dá)水平明顯低于g D; ELISA結(jié)果顯示，單獨(dú)表達(dá)的g D和g B以及共表達(dá)產(chǎn)物都能與B病毒陽(yáng)性血清反應(yīng)，但共表達(dá)產(chǎn)物的反應(yīng)強(qiáng)度高于單獨(dú)表達(dá)的g D和g B;重組蛋白經(jīng)變性處理后，g B蛋白的吸光度值降幅最大。結(jié)論：自裂解肽T2A能夠?qū)崿F(xiàn)不同分子共表達(dá)且保持獨(dú)立和完整的分子結(jié)構(gòu)；共表達(dá)猴B病毒g D和g B分子有利于提高抗體檢測(cè)的敏感性。

[關(guān)鍵詞]  自裂解肽T2A；g D；g B；猴B病毒

[中圖分類號(hào)]  Q78; R392.1  [文章編號(hào)]  1009-0002(2016)02-0163-05

 猴B病毒(B virus，BV)是a單純皰疹病毒屬家族成員，也是當(dāng)前影響實(shí)驗(yàn)猴質(zhì)量的重要病原之一。在人工繁殖的非SPF實(shí)驗(yàn)猴群中，B病毒感染率囚管理水平和動(dòng)物年齡不同波動(dòng)于20%～90%之間。另外，B病毒滅活疫苗的低保護(hù)力以及動(dòng)物感染通常缺乏明顯的臨床表現(xiàn)，致使目前尚未建立猴B病毒防控的有效手段。

 g B和g D蛋白是皰疹病毒最重要的膜蛋白分子。對(duì)單純性皰疹病毒(HSV)的研究發(fā)現(xiàn)，g B和g D與細(xì)胞表面受體特異性結(jié)合，啟動(dòng)膜融合和病毒入侵，是病毒感染的主要途徑。同時(shí)，g B和g D在該家族病毒成員中相對(duì)保守，也是機(jī)體免疫應(yīng)答的重要靶點(diǎn)。在豬偽狂犬病病毒( PRV)血清抗體檢測(cè)中，g B和g D被認(rèn)為是最敏感的抗原。G B和g D在猴B病毒感染及機(jī)體免疫應(yīng)答中同樣發(fā)揮重要作用，早期研究顯示，g B和g D抗體是B病毒感染后最

早產(chǎn)生且效價(jià)最高的抗體；以g B和g D基因制備的DNA疫苗對(duì)免疫動(dòng)物有較好的保護(hù)作用。

 但是，目前在g B和g D重組蛋白制備過(guò)程中，原核表達(dá)產(chǎn)物通常為包涵體，難以獲得與天然結(jié)構(gòu)一致的重組蛋白；瞬時(shí)表達(dá)產(chǎn)物又存在量的限制等問(wèn)題。鑒于此，我們利用真核達(dá)系統(tǒng)并結(jié)合近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的自裂解肽2A技術(shù)，分別制備了表達(dá)g B和g D以及共表達(dá)g B和g D的工程細(xì)胞株，建立了重組蛋白制備的生產(chǎn)流程；在此基礎(chǔ)上，對(duì)重組蛋白的免疫原性和反應(yīng)原性進(jìn)行了探索，旨在為B病毒的防控奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1材料

 CHO-S細(xì)胞和pcDNA3.1表達(dá)載體由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所胡顯文博士惠贈(zèng)；大腸桿菌DH5a、卡那霉素等購(gòu)于博邁德生物公司；Lipofectin2000、G418、CD Forti CHO培養(yǎng)基、抗結(jié)團(tuán)試劑(anti-clumping agent)、谷氨酰胺、青霉素、鏈霉素、DMEM/F-12(1:1)、胎牛血清(FBS)等購(gòu)于Gibco公司；HRP標(biāo)記的兔抗猴IgG二抗購(gòu)于Sigma公司；鉆親和層析柱為GE公司產(chǎn)品。

1.2表達(dá)載體構(gòu)建

 以本室保存的質(zhì)粒pGMT-BV-g B（包含BV-g B的完整基因及優(yōu)化密碼子序列）和pGMT-BV- g D（包含BV-g D除跨膜區(qū)外的所有基因優(yōu)化密碼子序列）為模板，PCR擴(kuò)增g B基因的胞外區(qū)序列（上下游引物分別為BV-g B-F和BV-g B-R），將其插入載體pcDNA3.1的多克隆位點(diǎn)，形成表達(dá)載體pcDNA3.1-BV-g B；同時(shí)，將BV-g D-F和BV-g D-R l擴(kuò)增片段插入pcDNA3.1多克隆位點(diǎn)，形成表達(dá)載體pcDNA3.1-BV-g D。將BV-g D-F和BV-gD-R2擴(kuò)增片段插入pcDNA3.1多克隆位點(diǎn)，形成中間載體pcDNA3.1-BV- g D-I;最后，將T2A肽與BV-g B融合基因插入pcDNA3.1-BV-gD-I載體，形成pcDNA3.1-BV-gD-T2A-gB表達(dá)載體。參見(jiàn)圖1；引物及序列見(jiàn)表1。

 將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，通過(guò)氨芐西林篩選及測(cè)序鑒定，最后利用無(wú)內(nèi)毒素的質(zhì)粒提取試劑盒制備表達(dá)載體pcDNA3.1-BV-gB、pcDNA3.1-BV-g D和pcDNA3.1-BV-gD-T2A-gB.

1.3  高表達(dá)工程細(xì)胞篩選

 CHO-S細(xì)胞復(fù)蘇后先培養(yǎng)于含10% FBS的D/F培養(yǎng)基中，傳代2—3次后接種于24孔板，待細(xì)胞長(zhǎng)成單層；按Lipoferctin 2000的使用說(shuō)明將3種表達(dá)載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞，轉(zhuǎn)染細(xì)胞首先在含G418（800 μg/m L）的培養(yǎng)基中加壓連續(xù)篩選3周，每4～5 d換液一次；待細(xì)胞呈明顯生長(zhǎng)狀態(tài)后，再將G418的濃度分別提高到1500μg/m L，繼續(xù)加壓篩選3～4周，直到細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好；消化收集抗性細(xì)胞，用無(wú)抗性的培養(yǎng)基無(wú)限稀釋并接種于96孔板（每孔細(xì)胞數(shù)量0.5～2個(gè)），待細(xì)胞出現(xiàn)小集落時(shí)，更換為無(wú)血清培養(yǎng)基（CD FortiCHO中加入抗結(jié)團(tuán)試劑和4 m mol/L谷氨酰胺），繼續(xù)在370C、5% CO2條件下培養(yǎng)，直到細(xì)胞鋪滿孔的一半以上；取細(xì)胞培養(yǎng)上清包被ELISA板，用稀釋至1/10的猴B病毒陽(yáng)性血清進(jìn)行ELISA檢測(cè)，利用ELISA結(jié)果挑選表達(dá)量最高的細(xì)胞克隆。

1.4重組蛋白鑒定

將高表達(dá)克隆細(xì)胞先在培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，待細(xì)胞密度達(dá)到100～200萬(wàn)/m L時(shí)轉(zhuǎn)入搖瓶培養(yǎng)，每2d按起始體積的5%~10%加入濃縮培養(yǎng)基(CHO CD E f-ficientFeed B)；同時(shí)每2d檢查細(xì)胞密度和活力，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到千萬(wàn)級(jí)且活率為70%—80%時(shí)終止培養(yǎng)；離心收集細(xì)胞上清，利用SDS-PAGE和Western印跡鑒定蛋白的表達(dá)。

1.5  重組蛋白的ELISA評(píng)價(jià)

 用碳酸鹽緩沖液( pH9.6)將細(xì)胞培養(yǎng)上清中的總蛋白稀釋到5μg/m L，包被ELISA板，每100μL，4℃放置過(guò)夜；室溫下用含10%FBS和0.5%水解酪蛋白的PBS封板1 h；加入稀釋至1/10的猴B病毒陽(yáng)性血清和陰性血清(稀釋液為含10% FBS的PBS)，室溫下放置1 h；用含0.08% Tween-20的PBS洗滌3次，每次5 min;加入稀釋至1/25000的HRP標(biāo)記的兔抗猴IgG二抗(稀釋液為含10%兔血清的PBS)，室溫下放置1 h；用PBST洗滌3次，加入100

μL單組分TMB顯色液（湖州英創(chuàng)生物科技公司），室溫下避光放置15～20 min，最后加入50 μL 1 mol/L的硫酸終止顯色，在酶標(biāo)儀上讀取D值，測(cè)量波長(zhǎng)為450 nm，參比波長(zhǎng)為620 nm。

2結(jié)果

2.1 3種表達(dá)載體的構(gòu)建

 利用3對(duì)引物分別從質(zhì)粒pGMT- BV-g B和pGMT-BV-g D上擴(kuò)增得到含不同酶切位點(diǎn)的g B和g D基因片段，大小分別約為2300和1050 b p(圖2)。用Xho I和EcoR I雙酶切回收片段和質(zhì)粒pcDNA3.1（一），連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，抗性篩選后提取質(zhì)粒，測(cè)序結(jié)果顯示pcDNA3.1-BV-gB和pcDNA3.1-BV-gD序列正確。將pcDNA3.1-BV-gD及BV-T2A-gB-F和BV-T2A-gB-R擴(kuò)±曾產(chǎn)物分另0用EcoR I和BamH I雙酶切，同樣經(jīng)過(guò)回收、連接、轉(zhuǎn)化、質(zhì)粒提取和測(cè)序等過(guò)程，得到表達(dá)載體pcDNA3.1-BV-gD-T2A-gB。

2.2高表達(dá)工程細(xì)胞的構(gòu)建及篩選

 質(zhì)粒pcDNA3.1- BV- g B、pcDNA3.1- BV- g D和pcDNA3.1- BV- gD-T2A- g B分別轉(zhuǎn)染CHO-S細(xì)胞后，經(jīng)過(guò)中壓（800μg/m L G418）和高壓(1500 μg/m L G418)篩選及細(xì)胞的單克隆化過(guò)程，分別得到42、58和31個(gè)單克隆細(xì)胞集落（圖3）；ELISA檢測(cè)顯示，與BV陽(yáng)性血清反應(yīng)的單克隆細(xì)胞分別為4、34和22株。

2.3  重組蛋白的Western印跡鑒定

 根據(jù)ELISA結(jié)果，分別從3種表達(dá)不同外源蛋白的T程細(xì)胞中各挑選1株高表達(dá)細(xì)胞(簡(jiǎn)稱B3、D12、DB6)進(jìn)行流加培養(yǎng)，培養(yǎng)上清用于Western印跡檢測(cè)。結(jié)果顯示，B3在M r約iooxi03處出現(xiàn)單一帶，D12在M r約50Xl03處出現(xiàn)雜交帶，而DB6出現(xiàn)2條雜交帶。表明pcDNA3.1-BV-gD-T2A-gB中的g B和g D分別得到分泌性表達(dá)（圖4）。另外還可看出，g B無(wú)論是單獨(dú)表達(dá)或與g D共表達(dá)，其表達(dá)量都低于g D蛋白。

2.4重組蛋白與猴血清的反應(yīng)性評(píng)價(jià)

 測(cè)定3種細(xì)胞培養(yǎng)上清的總蛋白含量后稀釋至5 μg/m L，并與等量的碳酸鹽緩沖液(pH9.6)混合，包被ELISA板（每孔100 VL），分別用B病毒陽(yáng)性血清池（10份B病毒陽(yáng)性猴血清等量混合）和陰性血清池（10份B病毒陰性猴血清等量混合）進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)3種細(xì)胞上清都能與B病毒陽(yáng)性反應(yīng)，且都不與陰性血清反應(yīng)。其中，DB6的3個(gè)重復(fù)孔的D值最高，為1.533+0.052; B3的D值次之，為1.161±0.065；D12的D值最低，為0.724+0.063；而與陰性血清反應(yīng)的D值均小于0.1（圖5）。提示g D和g B共表達(dá)能提高抗體檢測(cè)的敏感性。

 將細(xì)胞上清變性處理（煮沸5～8 min）后再包被ELISA板，并用陽(yáng)性血清池和陰性血清池進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)變性蛋白與陰性血清反應(yīng)后的D值變化不明顯，而陽(yáng)性血清的的D值都出現(xiàn)明顯下降。其中D12的降幅較小，由非變性時(shí)的0.724+0.063降為0.500+0.034; B3的降幅最大，由非變性時(shí)的1.161±0.065降為0.574+0.03。提示g B蛋白的空間表位在誘導(dǎo)機(jī)體免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用（圖5）。

3討論

 B病毒以猴為自然宿主，但對(duì)人的致死率超過(guò)70%。當(dāng)前，由于缺乏對(duì)抗B病毒的特效藥物，快速準(zhǔn)確檢測(cè)抗體是防控該疾病的主要手段。檢測(cè)中采用的抗原主要是B病毒或其他高度同源的皰疹病毒（如SA8、HSV等），因而存在安全性和準(zhǔn)確性等問(wèn)題。鑒于重組蛋白在病原研究及防控中的重要意義，我們利用細(xì)胞工程并結(jié)合近年來(lái)新發(fā)展的自裂解肽2A技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了猴B病毒g B和g D蛋白的分別表達(dá)和共表達(dá)。結(jié)果表明，單獨(dú)表達(dá)時(shí)，g D的表達(dá)效率和水平明顯優(yōu)于g B蛋白，在42個(gè)BV-g B的細(xì)胞克隆中，培養(yǎng)卜清能與BV陽(yáng)性血清發(fā)生明顯反應(yīng)的僅有4株細(xì)胞；而58株BV-g D 工程細(xì)胞中，24株可在培養(yǎng)上清中檢測(cè)到g D表達(dá)。Werstern印跡結(jié)果也顯示，2種最高表達(dá)水平的細(xì)胞在培養(yǎng)時(shí)間和密度相似時(shí)g D雜交條帶明顯強(qiáng)于g B。g D蛋白表達(dá)水平較高是由于篩選到高表達(dá)細(xì)胞株，亦或是基因、轉(zhuǎn)錄、翻譯及翻譯后的成熟過(guò)程所致，目前尚不清楚。

 對(duì)具有自裂解功能的細(xì)菌和病毒的研究發(fā)現(xiàn)，裂解肽上游和下游基因在轉(zhuǎn)錄時(shí)形成完整的mRNA分子，但在翻譯時(shí)，由于裂解肽的存在，轉(zhuǎn)錄因子在上游基因翻譯完成后，不會(huì)從mRNA上脫落，而是啟動(dòng)下游基因翻譯。因此，裂解肽上游和下游基因在轉(zhuǎn)錄水平上是平衡的。利用自裂解肽進(jìn)行多基因共表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究也證實(shí)，上游和下游基因的轉(zhuǎn)錄水平是一致的。而本實(shí)驗(yàn)以自裂解肽為linker，將B病毒g D和g B基因共表達(dá)，但其蛋白表達(dá)水平在Western印跡檢測(cè)中差異明顯，說(shuō)明翻譯水平及翻譯后的成熟過(guò)程可能是導(dǎo)致g B低表達(dá)的主要原因。

 我們?cè)诶�用T2A構(gòu)建g D和g B共表達(dá)載體時(shí)，在上游C端加入了Ser-Gly-Ser-Gly序列，該序列被認(rèn)為能提高2A肽的剪切效率、促進(jìn)基因表達(dá)。而Western印跡表明，共表達(dá)細(xì)胞中只出現(xiàn)g D和g B雜交帶，在聚合蛋白處沒(méi)有雜交條帶，表明該系統(tǒng)中的剪切效率是完全的。

 對(duì)重組蛋白的血清學(xué)評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)表明，單獨(dú)表達(dá)的g D和g B及二者的共表達(dá)產(chǎn)物都能與B病毒陽(yáng)性血清反應(yīng)，但三者的反應(yīng)強(qiáng)弱不同，共表達(dá)產(chǎn)物反應(yīng)最強(qiáng)，g D的反應(yīng)最弱。Perelygina的早期研究也證實(shí)，B病毒重組g B蛋白在血清抗體檢測(cè)中的敏感性最高17I。在其他皰疹病毒的研究中，人們也發(fā)現(xiàn)g B蛋白是最理想的抗體檢測(cè)抗原。而本實(shí)驗(yàn)中，共表

達(dá)產(chǎn)物與陽(yáng)性血清的反應(yīng)性不僅明顯強(qiáng)于g D，同時(shí)也強(qiáng)于g B（D值為1.533+0.052 vs 1.161+0.065，說(shuō)明二者可能存在互補(bǔ)性。我們前期在B病毒其他重組蛋白的研究中也發(fā)現(xiàn)此現(xiàn)象，提示在利用重組蛋白檢測(cè)B病毒抗體時(shí)，多分子聯(lián)合使用可能是提高檢測(cè)效率的方向。另外，3種重組蛋白經(jīng)加熱變性處理后，與陽(yáng)性血清的反應(yīng)性明顯減弱，其中以g B蛋白的D值降幅最大，而g D的降幅較小。我們對(duì)目前被證實(shí)的g B和g D線性表位肽進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)g D上的表位(362GPARRGAPY370）與B病毒陽(yáng)性血清反應(yīng)最強(qiáng)（結(jié)果未給出）。G D上由于存在優(yōu)勢(shì)線性表位，可能是變性蛋白D值降幅較小的原因；而g B變性蛋白較大的降幅，說(shuō)明g B分子的空間表位是優(yōu)勢(shì)表位。

 總之，我們利用自裂解肽2A實(shí)現(xiàn)了B病毒g D和g B的共表達(dá)，日+重組蛋白保持了獨(dú)立、完整的結(jié)構(gòu)，為猴B病毒檢測(cè)及分子機(jī)制研究提供了新思路。