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 唐雅茹1，國立東1,2，王娜娜1，霍責成1*

1．東北農(nóng)業(yè)大學乳品科學教育部重點實驗室(哈爾濱150030)；2．黑龍江中醫(yī)藥大學藥學院(哈爾濱150030)

摘要對初步篩選得到的膽酸鹽水解酶活性高的2株乳桿菌進行了16S rDNA鑒定，結(jié)果表明，KLDS l.0317和KLDS l.0386均為植物乳桿菌。以�；敲撗跄懰猁}和甘氨脫氧膽酸鹽為底物，對兩株植物乳桿菌所產(chǎn)BSH的比酶活進行了測定，試驗證明了BSH具有底物特異性，且兩株菌降解甘氨結(jié)合膽鹽的能力強于�；墙Y(jié)合膽鹽；利用PCR技術(shù)克隆出膽酸鹽水解酶基因，翻譯成相應的氨基酸，并利用生物分析手段對bsh 1基因以及其預測氨基酸序列進行了對比分析，結(jié)果表明，兩株植物乳桿菌的bsh 1基因非常保守，且預測的氨基酸序列的相似性非常高，不低于98%。

關(guān)鍵詞植物乳桿菌；膽鹽水解酶基因：16S rDNA;酶活

 隨著人們生活水平的不斷提高，高血壓、糖尿病和冠心病等各種心血管疾病已經(jīng)成為了人群高發(fā)病，世界衛(wèi)生組織預測在未來的10年里，高膽固醇所引起的疾病將位居所有疾病死亡的人數(shù)之首。乳酸菌在食品生產(chǎn)中的應用具有悠久的歷史，被認為是安全可靠的益生菌。早在1977年．Mann和Spoerry[4]發(fā)現(xiàn)長期飲用乳制品的非洲Masai人的膽固醇水平明顯低于普通人。這一發(fā)現(xiàn)受到了廣泛的關(guān)注，并對研究乳酸菌降膽固醇功能起到了帶頭作用。DE smet指出乳酸菌能夠降低膽固醇與乳酸菌產(chǎn)的膽鹽水解酶有密切相關(guān)。

 膽鹽水解酶( Bile salt hydrolase，BSH)是微生物生長、繁殖過程中產(chǎn)生的一種代謝產(chǎn)物。該酶是bsh基因編碼的一種胞內(nèi)酶，對氧氣不敏感，適宜在微酸性環(huán)境下生長，能水解胃腸道中的結(jié)合態(tài)膽鹽（�；悄懰猁}和甘氨膽酸鹽），將其轉(zhuǎn)變生成氨基酸和非結(jié)合態(tài)膽酸，從而使血清中膽固醇含量降低。植物乳桿菌中同時存在4個bsh基因，分別命名為bsh l～bsh

 4，bsh 1比其他3種bsh表現(xiàn)出更高的降解膽鹽能力。通過對bsh基因組學方面的研究，讓人們對BSH的功能有了進一步的認識。

 對初步篩選得到的產(chǎn)膽酸鹽水解酶的2株乳酸菌進行16S rDNA鑒定；并對兩株菌所產(chǎn)BSH的活性進行了初步研究；利用PCR技術(shù)克隆出了編碼BSH相應的基因片段，并進行了對比分析。為乳酸菌在降膽固醇方面的研究提供參考依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

 植物乳桿菌KLDS l.0317、植物乳桿菌KLDS1.0386，教育部乳品重點實驗室保存。

1.2主要試劑與儀器

 �；撬帷⒏拾彼�、甘氨脫氧膽酸鹽、�；敲撗跄懰猁}：Sigma公司；水和茚三酮、牛血清白蛋白、考馬斯亮藍：天津基準化學試劑有限公司；試驗用水為蒸餾水。

  低溫冷凍離心機：上海市離心機械研究所；超聲破碎粉碎機：SCIENTZ公司；Biometra Tperson PCR儀：德國Biometra公司；紫外一可見分光光度計、厭氧箱：THERMO ELECERON CORPORATION公司。

1.3試驗方法

1.3.1  菌種16S rDNA鑒定

 將試驗菌株KLDS l.0317和KLDS l.0386在MRS液體培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)。利用細菌基因組DNA提取試劑盒提取2株菌的總DNA。以所提總DNA為模板，通用引物27F( AGAGTTTGATCCTGGCTCA)，1492R( TACGGCTACCTTGTTACGACTT)進行PCR克隆。反應條件：95 ℃預變性4 min；94℃變性1 min，58℃退火1 min，72℃延伸2 min，30個循環(huán)；72℃延

伸7 min。PCR產(chǎn)物利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并用凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。送由華大科技公司測序。測序結(jié)果同NCBI數(shù)據(jù)庫中的相關(guān)菌株構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.2膽酸鹽水解酶活力的測定

 將菌株KLDS l.0317和KLDS l.0386在MRS固體培養(yǎng)基上劃線，37℃厭氧箱中培養(yǎng)24 h，挑取單菌落接種于MRS液體培養(yǎng)基中，活化兩代后，培養(yǎng)15 h至平臺初期。配制20 mg/L的牛磺酸（�；撬幔�標準溶液，分別稀釋成質(zhì)量濃度為0，4，8，12，16和20 mg/L的溶液，取稀釋液2 m L于試管中，加1 m L茚三酮顯色液，漩渦震蕩混勻，沸水浴15 min，冷卻后加1 m L95%乙醇，充分混勻，測570 nm處吸光度。以�；撬幔ǜ拾彼幔┵|(zhì)量濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制標準曲線。BSH酶活測定方法。

1.3.3蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度的測定

 稱量1g牛血清白蛋白，溶解并定容到1L，配成1 g/L的標準溶液。稀釋成質(zhì)量濃度為0，0.05，0.1，0.15，0.2，0.25，0.3和0.35 g/L，分別吸取300μ L各濃度標準溶液和粗酶液至干凈試管，加入3 m L蛋白質(zhì)顯色液，充分混勻，常溫放置2 min后迅速測量在595 nm波長下的吸光度。

1.3.4  bsh 1引物設(shè)計及合成

  從NCBI數(shù)據(jù)庫獲得多個植物乳桿菌膽酸鹽水解酶

基因序列，用Primer premier 6.0軟件設(shè)計bsh 1引物，

1.3.5bsh 1基因的克隆及檢測

 提取菌株的總基因組為模板，用合成的bsh 1引物進行PCR，反應條件：95℃預變性5 min；95℃變性30 s．46℃退火30 s．72℃延伸90 s，35次循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，后送由華大科技公司測序。

1.3.6bsh 1基因同源性分析

 用Primer premier 6.0軟件將BSH序列翻譯成相應氨基酸，登陸NCBI數(shù)據(jù)庫，通過Blast比對蛋白質(zhì)相似性；利用HMMER功能鑒定保守域；并用Vector NTI 10進行蛋白同源性比對，分析BSH氨基酸序列之間的關(guān)系。

2結(jié)果與分析

2.1  菌種16S rDNA鑒定結(jié)果

 將乳桿菌KLDS l.0317和KLDS l.0386的16S rDNA的測序結(jié)果提交到GENBANK，進行BLAST比對，結(jié)果表明，KLDS l.0317和KLDS l.0386與已發(fā)表的植物乳桿菌16S rDNA同源性為100%，說明這兩株菌為植物乳桿菌，圖1為2株菌的16S rDNA系統(tǒng)進化樹。

2.2甘氨酸、�；撬針藴是�線

 如圖2~圖3所示，甘氨酸標準曲線方程為：y=0.042 8x+0.000 7，R2=0.999 4；�；撬針藴是�線方程為：y=0.022x-0.001 2，R2=0.998;都有良好的線性相關(guān)性，可用于酶活測定。

2.3  比酶活測定結(jié)果

 比酶活定義為每毫克蛋白質(zhì)所含膽酸鹽水解酶的單位(U)數(shù)，計算公式為式(1)。

 2株乳桿菌KLDS l.0317和KLDS l.0386的比酶活測定結(jié)果如表1所示，都具有膽酸鹽水解酶活性，而且都能降解�；敲撗跄懰猁}和甘氨脫氧膽酸鹽，但在甘氨脫氧膽酸鹽中的水解能力更強，說明膽鹽水解酶的水解能力與氨基酸側(cè)鏈基團有密切關(guān)系。其中，KLDS 1.0386的比酶活明顯高于KLDS 1.0317。

2.4膽酸鹽水解酶保守區(qū)的比對

 N-末端親核水解酶家族在自然界廣泛分布，這些酶的共同特征是N端都有一個半胱氨酸殘基，酶被水解后，半胱氨酸即成為活性位點。BSH序列用Primerpremier 6.0軟件翻譯成相應蛋白，在NCBI上對BSH序列進行保守區(qū)序列比對，結(jié)果如圖4所示，BSH屬于N-末端親核水解酶家族，其中半胱氨酸（Cys-1）的位點是十分保守的。

2.5  BSH氨基酸序列相似性分析

近年來，研究植物乳桿菌中BSH的居多，例如植物乳桿菌L．plantarum RK21、植物乳桿菌L．plantarumMBUL91、植物乳桿菌L-plantarum Lp-onlly和植物乳桿菌L．plantarum NCDC201等。通過Primer premier 5.0軟件翻譯成氨基酸序列進行比較，結(jié)果如表2所示。植物乳桿菌的BSH氨基酸序列相似性非常高，都在98%以上。

2.6  BSH氨基酸保守性分析

 利用軟件Vector NTI 10對植物乳桿菌KLDS l.0317和KLDS l.0386以及NCBI數(shù)據(jù)庫中的植物乳桿菌P-8、植物乳桿菌WCFS 1和植物乳桿菌ST-III進行BSH保守性分析。橙色顯示部分為5株菌共有的氨基酸序列，藍色顯示為部分擁有�？梢钥闯�5株菌保守性都較高，在70 b p以后的堿基序列部分2株菌與數(shù)據(jù)庫已知的bsh 1序列相似性極高。

3結(jié)論與討論

  11試驗采用bsh 1基因特異性引物對植物乳桿菌KLDS 1.0317和KLDS l.0386進行了PCR擴增，測序結(jié)果與NCBI上已發(fā)表的膽鹽水解酶基因(EU822811)同源性為99%，故確認該2株菌含有膽鹽水解酶基因，并對膽酸鹽水解酶的核苷酸序列進行了分析。結(jié)果可知，膽酸鹽水解酶序列十分保守；將核苷酸序列翻譯成氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌KLDS 1.0317和KLDS 1.0386與植物乳桿菌RK21、植物乳桿菌MBUL91、植物乳桿菌Lp-onlly和植物乳桿菌NCDC 201的氨基酸相似度都很高，不低于98%;其氨基酸序列的保守性也很高。

  21試驗通過茚三酮比色法定量測得了2株植物乳桿菌的膽酸鹽水解酶的比酶活，在兩種底物下測得的酶活有差異。Begley和Gahan等提出，細菌的膽酸鹽水解酶既能識別固醇側(cè)鏈，又能識別氨基酸側(cè)鏈，因此由結(jié)果可知，植物乳桿菌KLDS l.0317和KLDS1.0386能夠識別氨基酸側(cè)鏈，并且水解甘氨脫氧膽酸鹽的能力強于�；敲撗跄懰猁}，與Maire等研究表

明，大部分膽鹽水解酶對底物的水解效率是�；撬岬陀诟拾彼岬氖聦嵪喾�。